腫瘤分子診斷

1、腫瘤分子診斷服務(wù)介紹,,,,,,,2,標(biāo)準(zhǔn)化用藥,個體化用藥,標(biāo)準(zhǔn)化用藥,,個體化用藥,標(biāo)準(zhǔn)療法1,標(biāo)準(zhǔn)療法2,標(biāo)準(zhǔn)療法3,,,,,,,腫瘤藥物與相關(guān)靶標(biāo),,,4,如何實現(xiàn)個體化用藥？,分子分型 藥物療效,,,,體細胞基因突變檢測,,mRNA表達檢測,循環(huán)腫瘤細胞（CTC)檢測,基因多態(tài)性檢測,體細胞基因突變檢測,,EGFR, K-RAS, B-RAF，C-KIT,1、基因突變檢測技術(shù),,8,—— qPCR-HRM（可用

2、于血漿標(biāo)本檢測）—— Taqman-ARMS（與國際獲批的技術(shù)相當(dāng)）—— DNA測序（基因突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)）,突變檢測技術(shù)之一 Taqman-ARMS,,9,所有定量PCR儀均可使用。 主要用于各類組織，包括手術(shù)、穿刺或鏡檢組織類。 2小時即可完成檢測 試劑盒商業(yè)化程度高，臨床認可程度高 國內(nèi)已有試劑盒獲批SFDA,突變檢測技術(shù)之一 qPCR-HRM,,10,qPCR-HRM技術(shù)是基于高效穩(wěn)健的PCR上的

3、高分辨熔解曲線分析（High-Resolution Melting）技術(shù)，靈敏度可以達到1%-0.1%，既能檢測已知突變，也能檢測未知突變。 qPCR-HRM的突變檢測已獲國際多中心雙盲實驗驗證（Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 11, No. 6, November 2009）。,實例圖：利用HRM技術(shù)對7個樣本分別進行EGFR（左圖）、KRAS（右圖）突變檢測，紅色表示該樣本

4、發(fā)生突變，藍色表示未突變，藍色橫直線為陰性對照。左圖顯示2個樣本發(fā)生了EGFR突變；右圖顯示4個樣本發(fā)生了KRAS突變。,EGFR,KRAS,,,11,血漿EGFR突變檢測： 18號外顯子：無突變19號外顯子：突變20號外顯子：無突變21號外顯子：無突變附圖,,,主要特點： 實現(xiàn)血漿中來自腫瘤的微量DNA的突變檢測。 目前所做的臨床實驗中，血漿EGFR檢測結(jié)果與其手術(shù)標(biāo)本之間的整體符合率符合率達到91.25%。

5、 是臨床上不能手術(shù)、也同時不愿穿刺患者的替代檢測方案；也可 獲得性耐藥進行預(yù)先檢測。,qPCR-HRM用于血漿微量突變檢測,,國際公認的分子檢測金標(biāo)準(zhǔn)有明確的物價收費實驗流程較復(fù)雜，需要大型儀器,突變檢測技術(shù)之一 DNA測序,,,突變檢測項目列舉,,EGFR突變檢測,EGFR E19 / E21敏感突變 適合使用TKI藥物治療,,耐藥位點檢測T790M,,,K-RAS突變檢測,,,BRAF,NCCN,,

6、2010年NCCN《結(jié)直腸癌臨床實踐指南》指出： K-ras基因為野生型而同時具有BRAF V600E突變的患者，靶向EGFR抗體治療無效。,,BRAF-V600E檢測,腫瘤學(xué)臨床實踐指南（中國版）2010第一版,指導(dǎo)腫瘤靶向治療的靶標(biāo),,基因多態(tài)性檢測與藥物代謝毒性(UGT1A1,CYP,DPD),,,,,2024/3/4,19,單核苷酸多態(tài)性（SNP）是最常見的基因變異,至少1%的人群,絕大多數(shù)人群,共有序列,G to

7、C,SNP 位點,變異的序列,,,最常見的基因多態(tài)性 SNP,,,2024/3/4,20,,為什么 SNPs 重要?,個體 1,個體 2,= SNP variations in DNA,SNP標(biāo)志基因 A,基因 B,基因 A,SNP 可能使基因 B 產(chǎn)生變異的蛋白質(zhì)分子,,,2024/3/4,21,個體的SNP 譜,SNP 譜A,SNP 譜B,SNP 譜C,SNP 譜F,SNP 譜E,SNP 譜D,,,2024/3/4,22,SNP

8、 譜有助于確定藥物的療效和副作用,乳腺癌病人,個體的SNP 譜可以分成不同的類型,SNP 譜 A,對藥物有期望的反應(yīng),,,對藥物沒有期望的反應(yīng),,SNP 譜 A的人對藥物有期望的反應(yīng),SNP 譜E,SNP 譜 B,SNP 譜 C,SNP 譜D,,,藥物代謝與SNP檢測,化療藥物在體內(nèi)經(jīng)過吸收、代謝、分布和清除，通過其活性物質(zhì)對治療靶點的直接攻擊而發(fā)揮作用，整個過程需要多種蛋白質(zhì)/酶的共同參與和協(xié)同作用。SNP 主要是指在基因組

9、水平上變異頻率大于1%的單核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性，多態(tài)性會導(dǎo)致不同個體體內(nèi)各種蛋白，酶活性的差異，因此導(dǎo)致藥物使用情況的不同。,,,,,,膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因（UGT1A1）,UGT1A1*27(C686A)或UGT1A1*28[(TA)7TAA]: 野生型：6個TA UGT1A1*6(G211A)：,使UGT1A1的轉(zhuǎn)錄活性下降了三分之二。導(dǎo)致對伊立替康的毒性增加。,FDA提示：UG

10、T1A1的多態(tài)性-伊立替康的毒性增加(6TA),此型的酶活性是野生型的49％ 。,,,CYP19A1 多態(tài)性影響芳香化酶抑制劑療效,,25,CYP19A1是芳香化酶的編碼基因，臨床研究已證實有著很大的影響作用。在接受芳香化酶抑制劑治療的乳腺癌患者中，攜帶CYP19A1基因rs4646（G>T）突變患者的治療效果較無此突變的患者顯著2-4（下圖）。CYP19A1 rs4646（G>T）SNP是乳腺癌患者接受芳香化酶抑制劑治

11、療療效的有效預(yù)測指標(biāo)。,如圖一項對乳腺癌患者的臨床研究顯示：CYP19A1基因rs4646突變的患者使用芳香化酶抑制劑藥物療效明顯優(yōu)于野生型患者（p<0.0001）1。,參考文獻1. Ian ES et al. N Engl J Med. 2003;384:2431-42.2. Ramon C et al. Clin Cancer Res. 2008;14:811-6. 3. Lunardi G et al. J Clin

12、Oncol. 2009; 27: 555. 4. Fasching PA et al. Breast Cancer Res Tr. 2008;112:89-98.,基因表達檢測（mRNA表達）(ERCC1\BRCA1\TUBB3\TS),,,基因表達檢測指標(biāo)（靶向藥物）,,28,HER2基因表達檢測,采用RT-PCR方法替代FISH或免疫組化方法，臨床準(zhǔn)確率達97%以上。主要特點：客觀，不用人為觀察。時間短，整個檢測60分鐘

13、左右完成。高通量，一次可以檢測6人份。,,,PDGFRα 低表達患者的無進展生存期和總生存期明顯長于高表達患者,,,,,化療藥物與檢測靶標(biāo),,ERCC1表達與鉑類藥物療效相關(guān)的臨床數(shù)據(jù),ERCC1陰性患者，能從鉑類輔助化療中獲益.,,,BRCA1/2表達與鉑類藥物療效相關(guān)的臨床數(shù)據(jù),BRCA1過度表達鉑類耐藥的預(yù)測因子 抗微管類藥物的敏感因子,,,,,34,低TS mRN

14、A水平的腫瘤患者接受氟類化療的效果較好，中位生存期較長。 TS低表達的患者對培美曲賽的療效好。,TS高表達影響氟類和培美曲塞藥效,Shirota Y et al. J Clin Oncol. 2001;19:4298-304,化療藥物與檢測靶標(biāo),,小 結(jié),,NSCLC個體化用藥系統(tǒng)方案,,,遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌（HNPCC)是由DNA錯配修復(fù)基因（MMR)發(fā)生基因突變導(dǎo)致的一種單基因的顯性遺傳疾病，又稱lynch綜合癥，發(fā)生

15、基因異常的個體其患發(fā)結(jié)直腸癌的風(fēng)險約為60%。,HNPCC實驗室檢測流程,,,1 背景介紹之HNPCC與MMR MSI,目前已發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致人類HNPCC發(fā)生的MMR有MSH2、MLH1、MSH6、PMS1、PMS2，其中MSH2和MLH1基因的功能最重要，其突變占已發(fā)現(xiàn)突變的90%左右。,39,1 背景介紹之HNPCC與MMR MSI,研究顯示， 約有86%-95%的HNPCC具有MSI特征， 而散發(fā)型大腸癌中只有16%。 MSI所產(chǎn)生的

16、遺傳不穩(wěn)定性將加速惡性腫瘤的發(fā)生。1997年美國NCI (national cancer institution)將MSI確定為檢測和篩選HNPCC的重要方法之一，并推薦將BAT26、BAT25、D2S123、D5S346和D17S250 5個位點作為檢測HNPCC的位點。,40,實驗室檢測流程,,,HNPCC檢測項目,,標(biāo)本要求,,腫瘤在變,"We can look at tumors for changes at t

17、he DNA, RNA and protein levels. It certainly gives us a way of looking at what is happening inside a tumor, and that's very exciting." Dr. Gordon MillsChair Systems BiologyMD Anderson Cancer CenterHouston,

18、 TxAs reported in“The Cancer Test” – TIME (June 14, 2007),http://www.time.com/time/magazine/article/0,9171,1633070,00.html,,,循環(huán)腫瘤細胞,1869年 Aust Med J，Ashworth最早在轉(zhuǎn)移性癌癥患者血液中觀察到。2005年 N Engl J Med，Cristofanilli證實治療前CTC數(shù)目

19、是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者無進展生存期和總生存期的獨立預(yù)測因子。,循環(huán)腫瘤細胞指從實體瘤中脫離出來并進入外周血液循環(huán)的腫瘤細胞。,獲取CTC需要解決的技術(shù)問題,從紅細胞和白細胞中富集惡性腫瘤細胞將惡性腫瘤細胞與紅細胞、白細胞、正常上皮細胞、造血干細胞等區(qū)分開來,每10mL血液中可能僅含有幾個到幾十個循環(huán)腫瘤細胞，而10mL血液中含有的白細胞約有1億個，紅細胞有500億個。,三種技術(shù),過濾法,ISET: Isolation by Size

20、of Epithelial Tumor cells8μm孔徑過濾膜，漏檢體積較小的腫瘤細胞敏感性低,梯度密度法,腫瘤細胞和單核細胞密度小于1.077g/mlCTC純度低，混入較多白細胞腫瘤細胞會遷移至血漿層，而聚集后容易下沉聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)對細胞有毒性,免疫磁珠法,腫瘤細胞表面抗原EpCAM與包繞著磁珠的特異性單抗相結(jié)合CellSearch細胞保存方法長達96小時實驗室室間差異小EpCAM

21、的假陽性和假陰性,CellSearch 是全球第一也是唯一經(jīng)FDA批準(zhǔn)可用于臨床的循環(huán)腫瘤細胞（CTC）產(chǎn)品,,1983 磁流體,如何鑒別出CTC?,,CTC,Anti-EpCAM磁珠,Anti-CK-PE,NucleusDAPI,CK,EpCAM,,在CellSearch®檢測中，CTC 被設(shè)定為：EpCamCK-8,18 和/或19DAPI CD45,+++-