hiv核酸檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用

1、HIV核酸檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用,目 錄,HIV核酸簡(jiǎn)介HIV核酸檢測(cè)意義HIV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀與發(fā)展HIV核酸檢測(cè)質(zhì)量控制HIV核酸檢測(cè)流程（新規(guī)范）HIV核酸檢測(cè)實(shí)例應(yīng)用,HIV病毒,病毒顆粒：呈球形，直徑100-120nm 病毒衣殼：呈20面體立體對(duì)稱 病毒核心：由RNA（兩條ssRNA）、核衣殼蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶及整合酶所組成,HIV RNA,,HIV生活周期圖,,,HIV前病毒DNA,HIV感染的自然史,HIV

2、感染后標(biāo)志物變化時(shí)間,HIV核酸檢測(cè)的意義,HIV核酸,縮短窗口期,指導(dǎo)治療,自然史,艾滋病的“元兇”,病程,耐藥性,HIV核酸檢測(cè)的意義,HIV-1感染診斷嬰兒感染早期診斷（小于18月齡）HIV-1感染補(bǔ)充試驗(yàn)及急性期和晚期感染者的診斷治療效果監(jiān)測(cè) 通常在治療一個(gè)月后病毒載量降低0.5log以上才被認(rèn)為臨床治療有效，六個(gè)月后應(yīng)降到小于檢測(cè)限病程監(jiān)控及預(yù)測(cè)耐藥性監(jiān)測(cè),HIV核酸檢測(cè)技術(shù),分為HIV定性和HIV

3、定量檢測(cè)兩大類：HIV定性檢測(cè)：HIV核酸（RNA和前病毒DNA）的檢測(cè)HIV定量檢測(cè)：又稱HIV病毒載量檢測(cè)（Viral load），主要用于抗病毒治療患者的療效評(píng)價(jià)，也可用于補(bǔ)充試驗(yàn)（新規(guī)范）,HIV核酸定性檢測(cè),IN-HOUSE（文獻(xiàn)報(bào)道）Roche Amplicor HIV-1 DNA PCR, v1.5試劑盒(已停產(chǎn))Roche COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®

4、; HIV-1 Qualitative Test,v2.0雅培RealTime HIV-1定性檢測(cè)試劑盒HIV病毒儲(chǔ)存庫(kù)的檢測(cè)技術(shù)（超敏PCR）,In-house普通PCR診斷方法,核酸提取,,,PCR或RT-PCR擴(kuò)增,,電泳鑒定或測(cè)序,HIV-1的基因組結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)蛋白,酶類,衣殼蛋白,~9.2kb,檢測(cè)設(shè)計(jì)：分別針對(duì)HIV gag、env和pol的三個(gè)獨(dú)立PCR檢測(cè)體系，并另外設(shè)立1個(gè)檢測(cè)內(nèi)參（β-actin）的檢測(cè)體系（國(guó)家艾

5、滋病參比實(shí)驗(yàn)室）陽(yáng)性：擴(kuò)增出人β-actin，HIV-1 gag 、env和pol基因中擴(kuò)增出2個(gè)及以上基因片段陰性：擴(kuò)增出人β球蛋白基因，HIV-1 gag 、env和pol 3個(gè)基因都沒有擴(kuò)增出來(lái)不確定：人β球蛋白基因未擴(kuò)增出預(yù)期的片段或HIV-1 gag 、env和pol 3個(gè)基因只擴(kuò)增出一個(gè),In-house普通PCR診斷方法,“套式”PCR,優(yōu)點(diǎn): 增加敏感性/特異性缺點(diǎn): 增加擴(kuò)增偏差機(jī)會(huì) 需要增加操作

6、過(guò)程 容易增加污染機(jī)會(huì),瓊脂糖凝膠電泳,,β-actin,gag,env,pol,In-house 熒光PCR,國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道以HIV RNA或前病毒DNA作為檢測(cè)目標(biāo)，選擇LTR、gag、pol等基因作為靶基因，建立熒光PCR檢測(cè)方法,,,HIV核酸陰性,HIV核酸陽(yáng)性,羅氏HIV-1 Qual Test,基于COBAS® AmpliPrep® / COBAS® TaqMan 48平臺(tái)，用于HIV-1 R

7、NA和前病毒DNA的定性診斷，檢測(cè)樣本類型包括抗凝全血、血漿、血清、干血斑或干漿斑等,,The COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1 Qualitative Test, v2.0Dual-PCR target Assay design,gag:Targeted in previous Roche HIV-1 tests Large sequence databas

8、e from Roche’s Global surveillance programNot a drug target today,LTR:Targeted in Roche MPx blood screening testNot a drug target today,檢測(cè)總核酸（DNA/RNA）,檢測(cè)結(jié)果示例,陰性,陽(yáng)性,HIV核酸定量檢測(cè),HIV病毒載量(Viral Load)指體內(nèi)復(fù)制的病毒的數(shù)量，反映體液（一般是血漿）

9、中HIV病毒的含量1987年John首次提出病毒載量（viral load）的概念，體內(nèi)復(fù)制的病毒的數(shù)量是不能直接測(cè)量的，一般用血漿中HIV RNA的拷貝數(shù)代表HIV的病毒載量。 是HIV核酸的定量檢測(cè)，一般以血漿HIV RNA的拷貝數(shù)/ml表示,常用的HIV病毒載量檢測(cè)方法,主要核酸擴(kuò)增和信號(hào)放大擴(kuò)增兩種方法NASBA/Easy Q (Biomerieux,生物梅里埃)Cobas Amplicor/Taqman (Roche

10、，羅氏)m2000(Abbott，雅培)bDNA/Versant 440 (西門子)國(guó)內(nèi)：凱杰（匹基），科華，達(dá)安、東北制藥、萬(wàn)泰 麗珠、科華等,NucliSENS EasyQ,,,,,血漿樣本,miniMAG,easyMAG,病毒載量分析儀,引物 2,NASBA擴(kuò)增技術(shù)（nucleic acid sequence-based amplification,核酸序列依賴性擴(kuò)增法）,,,逆轉(zhuǎn)錄酶,逆轉(zhuǎn)錄酶,,,,,,,,,,,,,

11、,,T7 RNA聚合酶,逆相 RNA 擴(kuò)增物,RNase H引物 1,,,引物1 延伸,RNase H 和引物 2延伸,,,,,,,,,RNA,,,,,,T7 RNA 聚合酶,,,,,,,逆轉(zhuǎn)錄酶,逆轉(zhuǎn)錄酶,“分子信標(biāo)” 雜交,AMV-RT (鳥肉瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶):延伸形成RNA-DNA 雜交鏈 RNase H:降解雜交鏈中的RNAT7-RNA聚合:轉(zhuǎn)錄形成的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,T7啟動(dòng)子序列,,COBAS® Ampli

12、Prep® / COBAS® TaqMan48,COBAS® AmpliPrep® / COBAS® TaqMan48® 系統(tǒng),完整探針: 報(bào)告基團(tuán) (R) 的熒光被淬滅基團(tuán)(Q)抑制,,,,,,,,,,,,,,h?,,引物,引物,,探針被5’-外切核酸酶切掉,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,報(bào)告基團(tuán)的熒光發(fā)射,h?,R = 報(bào)告基

13、團(tuán) Q = 淬滅基團(tuán),TaqMan水解探針技術(shù),雅培HIV-1病毒載量?jī)x,m2000全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)HIV-1病毒載量自動(dòng)化檢測(cè)平臺(tái)（96通量）已認(rèn)證用于干血斑病毒載量檢測(cè)嬰兒HIV-1核酸檢測(cè)試劑盒用于實(shí)驗(yàn)室in-house方法的自動(dòng)化核酸提取此平臺(tái)同時(shí)有HBV病毒載量，HCV病毒載量及分型，HPV高危分型，MTB檢測(cè)，CT/NG檢測(cè)等試劑盒,,bDNA (Bayer versantTM),核酸信號(hào)的放大

14、！而非核酸分子的擴(kuò)增！,,,人工加樣試劑分裝,自動(dòng)化提取,人工配液PCR儀檢測(cè),臨床式半自動(dòng)使用方案,北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司,,,PCR儀結(jié)果導(dǎo)入,WanTag 全自動(dòng)核酸提取儀,PCR檢測(cè),HIV核酸定量檢測(cè)試劑-全自動(dòng)化平臺(tái),強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合整合Tecan加樣與Thermo核酸提取平臺(tái)高通量 同時(shí)可用，實(shí)現(xiàn)1h內(nèi)96份樣本的提取 高自動(dòng)化可自動(dòng)完成包括加樣、核酸提取與純化、PCR試劑配制與分配等擴(kuò)增前的所有操作采磁棒轉(zhuǎn)移技

15、術(shù)，有效避免氣溶膠污染中文自主操作界面，方便快捷,達(dá)安基因HIV病毒載量核酸檢測(cè)系統(tǒng),國(guó)產(chǎn)化！全自動(dòng)！,PANTHER系統(tǒng)——TMA（轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增）,簡(jiǎn)易的工作流程：“上樣”直接到“結(jié)果”，3.5小時(shí)得到第一個(gè)樣本結(jié)果，每分鐘一個(gè)結(jié)果，12個(gè)小時(shí)500個(gè)樣本,核酸檢測(cè)在新版規(guī)范主要內(nèi)容,新增補(bǔ)充試驗(yàn)的概念，補(bǔ)充試驗(yàn)包括抗體確證試驗(yàn)和核酸試驗(yàn)（定性和定量試驗(yàn)）新增核酸檢測(cè)流程，對(duì)復(fù)檢結(jié)果有反應(yīng)的情況，增加了可以選擇核酸診斷的策略

16、；對(duì)于HIV抗體確證結(jié)果不確定和疑似急性期感染的樣品建議采用HIV-1 核酸試驗(yàn)。修改了艾滋病感染產(chǎn)婦所生兒童HIV感染早期感染檢測(cè)流程,補(bǔ)充試驗(yàn)（核酸試驗(yàn)）,初篩+復(fù)檢+,HIV定性檢測(cè)試劑盒,試劑：必須是經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局注冊(cè)批準(zhǔn)、在有效期內(nèi)的試劑。嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。全球目前正式用于臨床診斷HIV-1 急性期感染的核酸檢測(cè)試劑比較少Gen-Probe 公司生產(chǎn)的Aptima HIV-1 RNA 核酸定性試劑盒Abbot

17、t公司生產(chǎn)的M2000 HIV-1 RNA/DNA 定性檢測(cè)試劑盒Roche公司生產(chǎn)的COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1 Qualitative Test,v2.0,HIV核酸定性檢測(cè) ——適應(yīng)范圍,（1）診斷嬰兒早期感染（2）診斷急性HIV-1感染。針對(duì)對(duì)HIV-1抗體篩查陰性、近期有流行病學(xué)史的個(gè)體,或確證結(jié)果不確

18、定的樣本,核酸定性檢測(cè)可用于診斷HIV-1急性期感染。（3）確定艾滋病病毒感染。針對(duì)HIV-1抗體篩查陽(yáng)性或確證結(jié)果不確定的個(gè)體，結(jié)合流行病學(xué)史和臨床病史，核酸定性檢測(cè)可用于HIV-1感染診斷。艾滋病晚期患者可能出現(xiàn)HIV抗體反應(yīng)不確定，可根據(jù)HIV核酸定性檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合臨床病史和CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)等情況，進(jìn)行綜合判斷，確定臨床診斷。,結(jié)果判讀與報(bào)告,檢測(cè)結(jié)果顯示“有反應(yīng)”或“檢測(cè)到”，報(bào)告“HIV-1核酸陽(yáng)性” ；檢測(cè)結(jié)果顯示“

19、無(wú)反應(yīng)”或“未檢測(cè)到”，報(bào)告“HIV-1核酸陰性”。核酸定性檢測(cè)值低于最低檢測(cè)限的結(jié)果，不能排除HIV-1感染，需根據(jù)流行病學(xué)史、臨床病史和實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行綜合判斷。目前國(guó)內(nèi)外沒有商品化的HIV-2核酸檢測(cè)試劑,HIV定量檢測(cè)的試劑盒,試劑：必須是經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局注冊(cè)批準(zhǔn)、在有效期內(nèi)的試劑。嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。NASBA/Easy Q (Biomerieux,生物梅里埃)Cobas Amplicor/Taqman (R

20、oche，羅氏)m2000(Abbott，雅培)bDNA/Versant 440 (西門子)國(guó)內(nèi)：凱杰（匹基），科華，達(dá)安、東北制藥、萬(wàn)泰 麗珠、科華等,HIV核酸定量檢測(cè) ——適用范圍,（1）監(jiān)測(cè)抗病毒藥物治療效果?？共《舅幬镏委熐昂螅ㄆ诓《据d量分析和監(jiān)測(cè)，結(jié)合CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，有助于抗病毒藥物治療方案的確定和修改。（2）監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展。定期檢測(cè)HIV-1病毒載量，有助于監(jiān)測(cè)感染者和

21、病人的病程變化，結(jié)合CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，為抗病毒藥物治療提供病毒學(xué)依據(jù)。（3）診斷急性HIV-1感染。針對(duì)HIV-1抗體篩查陰性、近期有流行病學(xué)史的個(gè)體，或確證結(jié)果不確定，核酸定量檢測(cè)可用于診斷HIV-1急性期感染。（4）確定HIV-1感染。針對(duì)HIV-1抗體篩查陽(yáng)性或確證結(jié)果不確定的個(gè)體，結(jié)合流行病、和臨床病史和CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)等，使用核酸定量檢測(cè)幫助確定HIV-1感染。,結(jié)果判讀與報(bào)告,用于治療效果和病程監(jiān)測(cè)：檢測(cè)值小

22、于試劑盒線性范圍下限，報(bào)告低于檢測(cè)限，檢測(cè)值大于等于試劑盒線性范圍下限，按照檢測(cè)值報(bào)告。 用于HIV-1感染的診斷：檢測(cè)值>5000 CPs/ml(或IUs/ml)，報(bào)告檢測(cè)值；檢測(cè)值≤5000 CPs/ml(或IUs/ml)，盡快再次嚴(yán)格按核酸檢測(cè)的要求采樣檢測(cè)，報(bào)告檢測(cè)值，結(jié)果>5000 CPs/ml(或IUs/ml)，報(bào)告檢測(cè)值，結(jié)果仍≤5000 CPs/ml，則需充分結(jié)合流行病學(xué)史、臨床病史、CD4+T淋巴細(xì)胞

23、計(jì)數(shù)和HIV-1抗體隨訪檢測(cè)結(jié)果等進(jìn)行綜合判斷檢測(cè)值低于最低檢測(cè)限不能排除HIV-1感染。 （注：目前國(guó)內(nèi)外沒有商品化的HIV-2核酸檢測(cè)試劑；由于核酸定量檢測(cè)方法獲得的低病毒檢測(cè)值可能是核酸污染所致的結(jié)果，根據(jù)國(guó)內(nèi)外的相關(guān)數(shù)據(jù)和報(bào)道，建議用5000 CPs/ml作為判斷結(jié)果的閾值，兩次定量檢測(cè)有助于準(zhǔn)確判斷結(jié)果）。,集合核酸定性檢測(cè) （Pooling PCR）,對(duì)高危人群抗體檢測(cè)陰性的樣品進(jìn)行集合核酸檢測(cè)，可及時(shí)發(fā)現(xiàn)窗口期

24、HIV-1 感染者；用于血液篩查可進(jìn)一步降低“殘余危險(xiǎn)度”該方法較單份樣品的核酸檢測(cè)具有更高的成本效益。,集合PCR,HIV 核酸即時(shí)檢測(cè)( POCT),HIV 核酸即時(shí)檢測(cè)是在發(fā)病或者發(fā)生事件的地點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，能快速獲得檢測(cè)結(jié)果并及時(shí)反饋一線醫(yī)務(wù)人員的一類檢測(cè)方法。POCT 檢測(cè)適用范圍廣泛，且可避免樣本長(zhǎng)途運(yùn)輸導(dǎo)致的質(zhì)量下降，非專業(yè)人員經(jīng)培訓(xùn)后也可操作。可用于HIV-1 感染、兒童早期HIV 感染的輔助診斷、疾病監(jiān)控及抗病毒藥物

25、療效評(píng)價(jià)。,HIV病毒載量的即時(shí)檢測(cè)1,HIV病毒載量的即時(shí)檢測(cè)2,質(zhì)量保證和質(zhì)量控制,實(shí)驗(yàn)室分區(qū)和環(huán)境,HIV-1 病毒載量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室原則上應(yīng)分為三個(gè)獨(dú)立工作區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品處理區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，并設(shè)在不同房間。嚴(yán)格要求三區(qū)的空氣流向：從試劑準(zhǔn)備區(qū)到樣品處理區(qū)，然后到擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，不能逆向流動(dòng)。,,儀器設(shè)備質(zhì)量控制,加樣器、溫濕度計(jì)須經(jīng)計(jì)量部門校準(zhǔn)，每年一次；冰箱、水浴箱用校準(zhǔn)合格的溫度計(jì)測(cè)量溫度，并做好記錄。要定期對(duì)HI

26、V-1 病毒載量檢測(cè)儀、實(shí)時(shí)熒光PCR 儀等儀器進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)。,檢測(cè)過(guò)程質(zhì)量控制,試劑盒有效并經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局注冊(cè)，使用無(wú)DNA和RNA酶的水；嚴(yán)格執(zhí)行儀器和試劑的SOP，不得擅自修改。HIV-1 核酸定性檢測(cè)每次實(shí)驗(yàn)建議加陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和試劑對(duì)照。定量檢測(cè)每次實(shí)驗(yàn)使用試劑盒提供的內(nèi)部質(zhì)控品（內(nèi)標(biāo)），并滿足內(nèi)部質(zhì)控品的要求；建議使用一個(gè)HIV-1 RNA 為5000～15000 cps /毫升的外部質(zhì)控品。,外部質(zhì)量控

27、制,,,PT樣品組成：每次5份，包括陰性、不同拷貝數(shù)的陽(yáng)性樣品。PT頻率：一年2次。PT樣品的接收與保存：接受考核樣品后填寫接收專用單，-70度以下保存。PT樣品的檢測(cè)：要求將考核樣品同實(shí)驗(yàn)室常規(guī)樣品一起檢測(cè)，由常規(guī)檢測(cè)人員進(jìn)行。PT結(jié)果的報(bào)告和處理：在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)上報(bào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。PT評(píng)分原則 將參與實(shí)驗(yàn)室反饋結(jié)果換算成對(duì)數(shù)值（Lg），再按同一種方法與同一個(gè)考核品的的所有實(shí)驗(yàn)室結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，算出平均值（M）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（S）。,

28、成績(jī)判定,根據(jù)每個(gè)參與考核實(shí)驗(yàn)室一年兩次所有考核品的結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分（每一個(gè)考核品的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)依照A與B條款），判定標(biāo)準(zhǔn)為： ①優(yōu)秀：所有考核品沒有問題； ②良好：有一個(gè)考核品滿足A中的條款； ③合格：兩個(gè)考核品滿足B中的條款 ④不合格：至少有三個(gè)考核品滿足A中的條款或至少一個(gè)考核品出現(xiàn)B中的條款。A條款：樣品結(jié)果在M+2.0S～ M+3.0S內(nèi)；樣品結(jié)果在

29、M-2.0S～ M-3.0S內(nèi)；考核結(jié)果報(bào)告沒及時(shí)上報(bào)；沒按要求上報(bào)原始記錄。B條款：樣品結(jié)果超過(guò)>M+3.0S；樣品結(jié)果<M-3.0S；假陽(yáng)性；假陰性；無(wú)效結(jié)果。,應(yīng)用實(shí)例1——窗口期病例,某年某月某疾控送檢一份HIV篩查陽(yáng)性標(biāo)本（MSM）。ELISA陽(yáng)性，硒標(biāo)陽(yáng)性WB確證gp160,p24。兩周后隨訪， ELISA陽(yáng)性，硒標(biāo)陽(yáng)性， WB確證gp160,p24。病毒載量51000 cp/ml。一月后再抽血復(fù)檢，EL

30、ISA陽(yáng)性，硒標(biāo)陽(yáng)性， WB確證gp160,gp120,p66,p51,gp41,p31,p24,p17。HI病毒載量120000cp/ml。,應(yīng)用實(shí)例2——晚期AIDS病人樣本,某年某月，某醫(yī)院送檢一份疑似HIV感染的樣本，有機(jī)會(huì)感染的住院病人。第一次檢測(cè)ELISA陰性，報(bào)HIV抗體陰性。臨床醫(yī)師要求確證試驗(yàn)，第二次檢測(cè)，ELISA和硒標(biāo)均為陰性，WB：gp160,p66, p51 ，不確定。病毒載量7500 IU/ml。CD4:

31、9個(gè)/µl一個(gè)月后復(fù)檢ELISA和硒標(biāo)仍為陰性， WB：p24±, p51±,p66±，病毒載量164000 IU/ml。有艾滋病的臨床表現(xiàn)，結(jié)合臨床表現(xiàn)最終臨床診斷為艾滋病。進(jìn)行抗病毒治療一月內(nèi)此病人已死亡,應(yīng)用實(shí)例3——嬰幼兒早期診斷,某嬰兒2012年8月出生，雙親均為HIV感染者，孕3月行母嬰阻斷44天第一次核酸檢測(cè)為陽(yáng)性177天第二次核酸檢測(cè)為陽(yáng)性出具”嬰兒HIV感染早期診斷檢

32、測(cè)結(jié)果陽(yáng)性”,應(yīng)用實(shí)例4——抗體假陽(yáng)性病例,某病例未經(jīng)過(guò)抗病毒治療，硒標(biāo)陽(yáng)性（某國(guó)產(chǎn)金標(biāo)為陰性），酶聯(lián)陽(yáng)性(BIO-RAD S/CO=11.8)，WB條帶（gp160,gp120）,病毒載量檢測(cè)TND1個(gè)月隨訪后硒標(biāo)陽(yáng)性，硒標(biāo)、酶聯(lián)陽(yáng)性，WB條帶（gp160,gp120）,病毒載量檢測(cè)TND,應(yīng)用實(shí)例5——抗病毒治療病例,某病例抗病毒治療史不詳，硒標(biāo)陽(yáng)性（某國(guó)產(chǎn)金標(biāo)為陰性），酶聯(lián)陽(yáng)性(BIO-RAD S/CO=11.8)，WB條帶（g

33、p160,gp120）,病毒載量檢測(cè)TND抗體的假陽(yáng)性 VS 抗體的真陽(yáng)性？？,HIV核酸檢測(cè)用于診斷的局限性1,若檢測(cè)目標(biāo)是HIV 的RNA核酸容易受抗病毒藥物的影響而檢測(cè)不到接受抗病毒治療，HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)不確定的樣本面臨診斷的困境,復(fù)制后的大量新病毒釋放到血液中,,HIV病毒儲(chǔ)藏庫(kù)存在方式,,59,,①環(huán)狀,②線性,③整合型,病毒DNA有三種存在方式,儲(chǔ)藏庫(kù)病毒處于靜止?fàn)顟B(tài); 細(xì)胞內(nèi)整合的HIV-1 DNA; 細(xì)胞活化

34、后能夠釋放病毒,CD45RO+/CD25-/CD69-/HLA-DR-,HIV“治愈”定義,完全治愈：體內(nèi)完全清除可復(fù)制的病毒A sterilizing cure would involve total elimination of all replication-competent HIV from the body.功能性治愈：病毒未完全清除，不治療、不復(fù)制、不進(jìn)展Functional cure, the virus

35、 may not have been completely eliminated but no HIV replication is detectable and individuals experience no disease progression in the absence of antiretroviral treatment.緩解： 不治療、病毒低水平(<50 copies/mL)Remission, the l

36、atest definition to enter the HIV cure dialog, refers to control of HIV viral load at low levels (such as below 50 copies/mL) in the absence of treatment.,相關(guān)研究（內(nèi)外）：Mississippi Child,2013 CROI (March 3-6, 2013)診斷：2個(gè)獨(dú)立H

37、IV檢測(cè)第30小時(shí)核酸定性檢測(cè)（陽(yáng)性 ）第31小時(shí)載量檢測(cè)（20,000拷貝/ml）,,,,功能性治愈Mississippi Child,療效 EfficacyHIV RNA < LDL (within 1m –HIV RNA < LDL 18、23-26 mHIV DNA fragments (+)HIV-specific antibodies (-),功能性治愈Mississipp

38、i Child,密西西比兒童：2014 CROI 41月齡，停藥22月以后，依然維持功能性治愈,VL <LDL (LDL=20 c/ml ，停藥23個(gè)月)HIV RNA <1 c/ml (停藥22個(gè)月)No replication-competent resting CD4 cell latent reservoir virusproviral DNA + (22個(gè)月),Very early treatment fo

39、rms a barrier to the formation of HIV reservoirs in perinatal infection.盡早治療可阻斷圍產(chǎn)期感染HI V形成儲(chǔ)存庫(kù),解決對(duì)策,Abbott公司生產(chǎn)的M2000 HIV-1 RNA/DNA 定性檢測(cè)試劑Roche公司生產(chǎn)的COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1 Qualitative Test,v2

40、.0（ HIV-1 RNA/DNA ）,使用針對(duì)HIV DNA或者RNA/DNA檢測(cè)試劑盒,HIV 超敏PCR試劑盒,海力特科技，服務(wù)精準(zhǔn)醫(yī)療,www.yourwebsite.com,1. HIV-1 DNA定量檢測(cè)試劑盒2. HIV-1 總核酸（RNA+DNA）檢測(cè)試劑盒3. HIV-1 Integrated DNA（前病毒）定量檢測(cè)試劑盒4. HIV-1 RNA定量檢測(cè)試劑盒5. HIV-1 spliced mRNA檢測(cè)試劑

41、盒6. HIV-1 2-LTR檢測(cè)試劑盒,www.supbio.com,HIV核酸檢測(cè)用于診斷的局限性-2,目前的HIV核酸檢測(cè)試劑盒只針對(duì)HIV-1型，且主要覆蓋其中的M組目前還沒有針對(duì)HIV-2型的核酸檢測(cè)試劑盒,79,P,HIV核酸檢測(cè)用于診斷的局限性-2,產(chǎn)品1：覆蓋HIV-1型的所有M組亞型產(chǎn)品2：可覆蓋HIV-1 M、O、N組各個(gè)亞型產(chǎn)品3：檢測(cè)HIV-1 M群中所有亞型及O、N和P組大多數(shù)亞型,HIV核酸檢測(cè)用于診

42、斷的局限性-3,每個(gè)HIV核酸檢測(cè)試劑盒都有其檢測(cè)限，如：20cps/ml，50 cps/ml，100 cps/ml。低于檢測(cè)限不能排除HIV感染。檢測(cè)限根據(jù)上樣體積變化而變化,NucliSENS EasyQ® HIV-1 v2.0,NucliSENS EasyQ® HIV-1 v2.0,NucliSENS EasyQ® HIV-1 v2.0,總 結(jié),HIV核酸試驗(yàn)作為補(bǔ)充試驗(yàn)可彌補(bǔ)HIV抗體確證的不