基于電化學(xué)分子信標(biāo)基因傳感技術(shù)的HIV-1核酸檢測新方法研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immune deficiency syndrome)簡稱艾滋病(AIDS)，是由人類免疫缺陷病毒(human immue deficiency virus，HIV)感染所引起的一種嚴(yán)重的傳染性免疫缺陷性疾病。目前我國局部地區(qū)和特定人群疫情嚴(yán)重，并逐漸由高危人群向一般人群擴(kuò)散，防治形勢非常嚴(yán)峻。根據(jù)血清學(xué)反應(yīng)的不同，HIV可分為HIV-1和HIV-2兩型，世界上絕大

2、部分地區(qū)(包括中國)流行的均為HIV-1。由于尚無有效治療措施，預(yù)防感染成為控制HIV-1蔓延的主要手段。而HIV-1感染的實(shí)驗(yàn)室診斷是艾滋病預(yù)防控制工作的重要組成部分，因此建立敏感實(shí)用的檢測方法用于監(jiān)測、診斷或血液篩查，對控制艾滋病的流行顯得尤為重要。
　　 目前臨床上應(yīng)用最為普遍的HIV-1血液篩查方法是基于顯色反應(yīng)的ELISA法，它主要針對血液中的檢測蛋白(如:抗原或抗體)，由于顯色反應(yīng)的靈敏度有限，其檢測HIV-1感染窗

3、口期較長，因此ELISA方法顯然不能滿足現(xiàn)階段對艾滋病早期篩查的需要。
　　 病毒核酸是HIV-1感染后出現(xiàn)最早的檢測指標(biāo)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，核酸檢測法已成為HIV-1感染早期檢測的重要手段。目前常用的測定方法有逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)(RT-PCR)、核酸序列擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)(NASBA)、分支DNA雜交實(shí)驗(yàn)(bDNA)等。近來使用高靈敏度的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，能夠在HIV-1感染的前2周檢測到病毒核酸。但檢測儀器、試劑昂貴，操作復(fù)雜

4、，對操作人員要求高，難以在一般實(shí)驗(yàn)室推廣，又不適用于對大量患者的快速檢測，所以同樣不適于廣泛的臨床應(yīng)用。因此，既要提高檢測的敏感性、特異性，縮短窗口期，又要簡便、快速和降低成本已成為HIV-1核酸檢測技術(shù)發(fā)展的要求和方向。
　　 生物傳感器由于集高效、靈敏、特異、小巧、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)于一身，目前已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。它利用各種類型的換能器，將待測的生物信號轉(zhuǎn)換為電、聲、光等可檢測的物理信號，從而實(shí)現(xiàn)對樣本中靶生物分子的檢測。

5、基于核酸雜交的基因傳感器是當(dāng)前發(fā)展最迅速的核酸檢測方法之一，用于基因傳感器的檢測技術(shù)包括熒光技術(shù)，石英晶體微天平，電化學(xué)發(fā)光，表面等離子共振光譜和電化學(xué)方法等。在這些方法中，電化學(xué)方法因其受環(huán)境干擾少、信號測量簡單、儀器成本低等優(yōu)點(diǎn)而引起了人們的廣泛關(guān)注。
　　 電化學(xué)基因傳感器是以核酸為敏感元件或檢測對象，將核酸分子特異性識別過程中產(chǎn)生的信號通過電化學(xué)換能器轉(zhuǎn)化為電信號，從而實(shí)現(xiàn)對核酸的定性或定量檢測。識別元件(核酸探針)和電

6、化學(xué)換能器(工作電極)是其兩大重要組成部分;其中核酸探針的性質(zhì)決定傳感器的識別特異性，而工作電極的電子傳導(dǎo)能力決定其敏感性。由于在檢測過程中將電化學(xué)方法的高靈敏度和核酸分子雜交的高度序列特異性結(jié)合起來，電化學(xué)基因傳感器有望成為實(shí)現(xiàn)簡便、快速、準(zhǔn)確、價(jià)廉的基因測定手段，并且符合HIV-1核酸檢測技術(shù)發(fā)展的要求和方向，能夠?qū)崿F(xiàn)HIV-1早期篩查。
　　 近年來，國內(nèi)外已報(bào)道多種HIV電化學(xué)基因傳感器，其中多數(shù)是由傳統(tǒng)微型電極(如微型

7、石墨電極、金噴濺電極等)上固定與HIV核酸片段互補(bǔ)的單鏈線性DNA探針分子構(gòu)建而來。但傳統(tǒng)電極電傳導(dǎo)性能有限，且線性單鏈DNA探針分子作為識別元件檢測特異性及靈敏度不高，如要將電化學(xué)基因傳感器用于成分復(fù)雜的臨床血液樣品檢測，需提高識別元件的識別特異性及靈敏度，同時(shí)進(jìn)一步優(yōu)化電極的電傳導(dǎo)性能，建立一種高特異、超敏感的電化學(xué)基因傳感檢測系統(tǒng)，為電化學(xué)傳感器在臨床HIV-1檢測中的應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 識別元件的結(jié)構(gòu)是影響其識別

8、特異性及靈敏度的重要因素。目前除了傳統(tǒng)的線性結(jié)構(gòu)以外，最常見的探針結(jié)構(gòu)當(dāng)屬莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)。人們最熟悉的莖環(huán)狀探針是分子信標(biāo)(molecular beacons，MBs)，它以其高特異性、高敏感度及可免分離實(shí)時(shí)監(jiān)測的優(yōu)點(diǎn)而成為最有效的熒光探針分子。但由于光學(xué)檢測系統(tǒng)體積龐大，價(jià)格昂貴，維護(hù)困難，需要專業(yè)化的人員操作，MBs已經(jīng)被引入電化學(xué)方法的構(gòu)建，被稱為電化學(xué)分子信標(biāo)(electrochemical MBs，E-MBs)。為了延續(xù)MBs在溶

9、液中以高信噪比免分離實(shí)時(shí)監(jiān)測的優(yōu)點(diǎn)，我們擬構(gòu)建一種類似于熒光檢測中二聚體-單體開關(guān)檢測模式的E-MBs，而獲得此種新型E-MBs的關(guān)鍵是要找到一種合適的電化學(xué)活性分子，其能標(biāo)記在E-MBs序列的兩端，且隨著E-MBs構(gòu)象的改變擁有不同的電化學(xué)特性。
　　 胭脂紅酸(Carminic acid，CA)是一種蒽醌化合物，單體形式的CA由于對二苯酚和奎寧基團(tuán)的存在而表現(xiàn)出電化學(xué)活性(ON狀態(tài))，而其二聚體形式電化學(xué)活性則會(huì)消失(OFF

10、狀態(tài))，即CA分子電化學(xué)信號的有無僅取決于其存在狀態(tài)。因此CA即我們能夠用來研制模擬熒光MB的電化學(xué)活性分子，擬構(gòu)建的新型電化學(xué)分子信標(biāo)稱為電化學(xué)活性-非活性開關(guān)分子信標(biāo)(electrochemically active-inactive switching MB)，由于其兩端均標(biāo)記有CA，故也可稱為胭脂紅酸-分子信標(biāo)(CAs-MB)。
　　 工作電極的電子傳導(dǎo)能力決定傳感器的敏感性，而電極的修飾是提高電極電子傳導(dǎo)性能的主要途徑

11、。近年來，電極修飾主要依靠納米材料來進(jìn)行，石墨烯(graphene)是只有一個(gè)碳原子厚度的二維材料，它是目前最薄卻也最堅(jiān)硬的納米材料，且電阻率極低，這使得石墨烯及其衍生物以其優(yōu)異的導(dǎo)電性能、大比表面積和良好的吸附能力被應(yīng)用于超級電容器、場效應(yīng)晶體管以及化學(xué)傳感器等領(lǐng)域。萘酚(nafion)是具有優(yōu)良化學(xué)穩(wěn)定性的陽離子交換劑，可增加石墨烯的溶解度，并將其穩(wěn)定固定于電極表面，形成萘酚石墨烯(Nafion-graphene)復(fù)合物膜。進(jìn)而使石

12、墨烯修飾更加均勻，導(dǎo)電性能更好。用此復(fù)合物膜修飾絲網(wǎng)印刷微電極(SPCEs)，構(gòu)成超靈敏電化學(xué)微電極:Nafion-graphene/ SPCEs作為本項(xiàng)目的工作電極。同時(shí)結(jié)合新型識別元件——CAs-MB，構(gòu)建出新型HIV-1的電化學(xué)基因傳感系統(tǒng)，并對其進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)，為電化學(xué)傳感器在臨床HIV-1核酸檢測中的應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為其它類型傳染病的快速核酸診斷提供通用平臺(tái)。
　　 圍繞以上問題，本論文的工作分為兩個(gè)部分:

13、>　　 (1) HIV-1電化學(xué)活性-非活性開關(guān)分子信標(biāo)的構(gòu)建及驗(yàn)證
　　 (2)基于Nafion-graphene/SPCEs的HIV-1電化學(xué)分子信標(biāo)基因傳感體系的構(gòu)建及方法學(xué)評價(jià)
　　 研究方法:
　　 1.HIV-1電化學(xué)活性-非活性開關(guān)分子信標(biāo)的構(gòu)建及驗(yàn)證
　　 合成并純化針對HIV-1 gag基因保守區(qū)序列的CAs-MB，用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)和循環(huán)伏安法(CV)驗(yàn)證其莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)

14、及信號開關(guān)現(xiàn)象，優(yōu)化CAs-MB與目的序列的雜交條件，并用差分脈沖伏安法(DPV)信號強(qiáng)度評價(jià)CAs-MB對HIV-1目的核酸序列的識別特異性。
　　 2.基于Nafion-graphene/SPCEs的HIV-1電化學(xué)分子信標(biāo)基因傳感體系的構(gòu)建及方法學(xué)評價(jià)
　　 在成功構(gòu)建并驗(yàn)證HIV-1 gag基因保守區(qū)識別元件——CAs-MB的基礎(chǔ)上，利用二維碳納米材料graphene導(dǎo)電性能強(qiáng)、比表面積大和吸附能力良好的優(yōu)點(diǎn)及N

15、afion溶液增加graphene溶解度，并可將其穩(wěn)定修飾于電極表面的特點(diǎn)，制成Nafion-graphene復(fù)合物膜。用此膜修飾SPCEs，構(gòu)成超靈敏電化學(xué)微電極:Nafion-graphene/ SPCEs作為本項(xiàng)目的工作電極。優(yōu)化graphene的修飾濃度，在含有0.1MKC(1)的5mM Fe(CN)63-/4-(1:1)的溶液中進(jìn)行CV和電化學(xué)阻抗譜(EIS)檢測，對工作電極的電化學(xué)性能進(jìn)行表征。驗(yàn)證CA單體在Nafion-g

16、raphene/SPCEs上的電化學(xué)響應(yīng)，并結(jié)合新型識別元件——CAs-MB，構(gòu)建出基于Nafion-graphene/SPCEs的HIV-1電化學(xué)基因傳感器，同時(shí)對其檢測HIV-1gag基因目的序列的性能進(jìn)行評價(jià)。
　　 結(jié)果:
　　 1、CA單體與CAs-MB的FT-IR圖變化證明CA已標(biāo)記于MB末端，CV圖證明CAs-MB電化學(xué)活性O(shè)N和OFF狀態(tài)的存在。DPV結(jié)果證實(shí)其能夠在電化學(xué)平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)對HIV-1gag基因

17、目的序列的特異性識別，且能夠區(qū)分一個(gè)堿基的差異。雜交反應(yīng)進(jìn)行的最佳溫度為60℃，最佳時(shí)間為30min。
　　 2、成功構(gòu)建了基于Nafion-graphene/SPCEs的HIV-1電化學(xué)基因傳感體系。Graphene濃度優(yōu)化后的Nafion-graphene/SPCEs在含有0.1 MKC1的5mMFe(CN)63-/4-(1:1)的溶液中的CV和EIS結(jié)果均顯示:Nafion-graphene/SPCEs作為工作電極電傳導(dǎo)效

18、率顯著增高，且對CA單體的DPV響應(yīng)信號遠(yuǎn)大于裸SPCE。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建出的基于Nafion-graphene/SPCEs的HIV-1電化學(xué)基因傳感體系在HIV-1gag基因目的序列濃度為40nmol/L～2.56μmol/L范圍內(nèi)，氧化峰電流改變值與目的核酸序列濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系，線性方程為I(10-6 A)=8.302 log10(Ctarget)-13.070(R2=0.982，P＜0.001)。檢出限可達(dá)15nmol/L。

19、r>　　 結(jié)論:
　　 本研究合成了HIV-1gag基因保守區(qū)的特異性識別元件——CAs-MB，驗(yàn)證其電化學(xué)活性O(shè)N和OFF狀態(tài)的存在，并證實(shí)其能夠在電化學(xué)平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)對HIV-1gag基因目的序列的特異性識別，且能夠區(qū)分一個(gè)堿基的差異。在此基礎(chǔ)上，以超靈敏電化學(xué)微電極:Nafion-graphene/SPCEs為工作電極，構(gòu)建出針對HIV-1的電化學(xué)基因傳感系統(tǒng)。本系統(tǒng)對HIV-1gag基因目的序列的檢測在40nmol/L～2