基于納米材料和功能核酸的光學傳感新方法用于酶活性檢測.pdf

1、近年來，生物傳感器因其靈敏度高、選擇性好、分析時間短、檢測成本低等特點，極大地推動了醫(yī)學臨床診斷和藥物篩選的發(fā)展。光學檢測技術具有操作簡便、無需分離、可以實現(xiàn)原位和實時活體測定等優(yōu)點，在建立生物傳感器方面正被越來越多的研究者所關注。此外，功能核酸和納米材料的發(fā)展為構建用于各種分析對象的生物傳感技術提供了全新的設計思路和平臺。本論文基于當前一些重要酶活性檢測及其相關藥物篩選中的研究熱點，重點探討如何提高檢測靈敏度、降低檢測成本等問題。將納

2、米材料、功能核酸的優(yōu)勢相結合，發(fā)展了一些光學檢測新技術用于堿性磷酸酯酶、多聚核苷激酶、腺苷脫氨酶、堿基切除修復酶等酶活性及其抑制劑的測定。和傳統(tǒng)方法相比，本論文所建立的檢測方法靈敏度高、操作簡便、分析成本低廉。同時還初步驗證了這些方法的實用性。具體內容如下:
　　 堿性磷酸酯酶(ALP)的測定在相關疾病的臨床診斷中具有重要作用。在第2章中，基于焦磷酸(PPi)對熒光銅納米粒子合成的抑制能力，以PPi為底物，建立了一種可在生理條件

3、下檢測ALP的無標記信號增強型方法。PPi可以和Cu2+之間形成很強的絡合物，該絡合作用將妨礙CuNPs的合成，造成熒光信號的降低。利用ALP對PPi的水解，使得PPi與Cu2+之間的絡合不能發(fā)生。在dsDNA模板的存在下，通過抗壞血酸對Cu2+的還原，CuNPs可以被有效地合成，從而熒光恢復，并且其恢復能力和ALP濃度直接相關。該方法不需要任何標記或者復雜的設計，操作簡便，分析成本低。并且該方法具有較高的靈敏度，其檢測下限達到0.1

4、nM。此外，信號增強模式也為ALP的測定提供了較好的選擇性。同時，還利用所建立的方法研究了磷酸根對ALP酶活性的抑制情況。在復雜環(huán)境中，該檢測方法同樣表現(xiàn)出了良好的分析性能。血清樣品中的回收率實驗結果令人滿意。
　　 多聚核苷激酶(PNK)對DNA的磷酸化修飾過程在DNA損傷修復、復制和重組中起著非常重要的作用。第3章中，利用雙鏈DNA模板法制備的熒光銅納米粒子(CuNPs)為信號指示劑，開發(fā)了一種無標記熒光方法用于PNK酶活性

5、的測定。實驗中，利用一段雙鏈DNA同時作為PNK的底物和CuNPs合成的模板。當PNK作用之后，雙鏈DNA模板將被磷酸化，導致雙鏈DNA立即被λ核酸外切酶降解。由于缺少了CuNPs合成所需的雙鏈DNA模板，該降解過程將抑制CuNPs的形成，造成熒光信號的下降。該測定方法不需要對底物DNA進行任何化學修飾或者復雜的序列設計，從而使整個實驗操作簡便，成本低廉。并且該方法選擇性好，靈敏度高，其檢測下限為0.49 U/mL。同時該檢測方法在復雜

6、體系中也具有較好的分析性能。
　　 腺苷脫氨酶(ADA)活性的測定及其抑制劑的篩選在臨床診斷中具有重要意義。第4章中，以腺苷脫氨酶為模型分析物，將氧化石墨烯對不同構象核酸吸附能力的差異和核酸適配體對目標識別的高特異性相結合，并利用SYBR greenⅠ作為熒光指示劑，構建了一種基于氧化石墨烯-適配體平臺的無標記高信背比熒光生物檢測方法。兩條劈開的適配體片段共同對腺苷的識別形成復合結構，熒光染料將嵌入適配體/腺苷復合物的雙鏈區(qū)域。

7、并且復合結構的形成也妨礙適配體片段在石墨烯表面的吸附，從而溶液具有較強的熒光信號。而腺苷脫氨酶對腺苷去氨基后，生成的次黃苷不能被適配體識別，適配體和熒光染料將吸附在石墨烯表面，導致熒光淬滅。該方法無需對適配體探針進行化學修飾，易于合成制備，降低了分析成本。同時，氧化石墨烯的超強熒光淬滅能力也為該方法提供了較高的靈敏度，其檢測下限為0.025 U/mL。該方法為基于適配體的其他生物分子的檢測提供了一個參考手段。第5章中，基于酶調控納米金團

8、聚策略，提出了一種無標記可視化分析方法用于腺苷脫氨酶及其抑制劑的便捷靈敏測定。該方法主要依賴于腺嘌呤堿基環(huán)外氨基與納米金之間的強烈作用，從而置換出納米金表面弱結合的檸檬酸根離子，降低了納米金穩(wěn)定性，最終造成納米金的團聚。而腺苷脫氨酶對腺苷的脫氨基反應將抑制這個腺苷依賴的納米金團聚現(xiàn)象。該方法無需其他輔助酶、核酸適配體或者化學修飾，使得整個測定過程簡便、低成本，分析速度快，并實現(xiàn)了腺苷脫氨酶均相可視化檢測。該方法動態(tài)范圍寬，靈敏度高，其線

9、性檢測范圍為0-15 U/L，檢測下限為0.8827 U/L。此外，該方法還實現(xiàn)了腺苷脫氨酶抑制劑的可視化篩選測定。
　　 堿基切除修復是DNA損傷修復過程中的重要途徑之一，其修復酶活性和多種疾病相關。在第6章中，以尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)為模型分析物，基于目標激活自催化DNA酶信號放大策略，建立了兩種新型熒光分析方法用于堿基切除修復酶活性的測定。其基本思路是利用UDG的作用激活DNA酶，在輔助因子的存在下催化循環(huán)切割信

10、標結構的底物探針，對目標的測定信號進行放大。首先，基于UDG作用將降低其底物的熔鏈溫度這一特性，利用一條雙鏈DNA底物來構建目標激活自催化DNA酶策略。UDG的作用將使得DNA酶從雙鏈底物中釋放出去，從而激活DNA酶對信標底物的催化循環(huán)切割。該方法具有較寬的動態(tài)范圍和較高的靈敏度，其線性檢測范圍為0-1.0 U/mL，檢測下限為0.023 U/mL。并且，該方法也被成功用于UDG的抑制劑測定。其次，將滾環(huán)放大(RCA)反應引入檢測體系構