一種基于“納米酶”體系的DNA檢測(cè)新方法.pdf

1、本文構(gòu)建了一種用于DNA雜交檢測(cè)的“納米酶”體系。首先通過(guò)檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法制備粒徑約15nm的納米金顆粒（Au Nanoparticles，AuNPs)，利用蛋白分子與納米金顆粒之間的相互作用，在納米金顆粒表面連接辣根過(guò)氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)分子，然后利用金硫鍵的作用在納米金表面組裝末端帶有巰基修飾的單鏈DNA檢測(cè)探針，構(gòu)成了一種以納米金為中心的“rDNA-納米金-HRP”結(jié)構(gòu)的納米

2、單元，集成了靶物質(zhì)檢測(cè)與信號(hào)放大功能，被命名為“納米酶”。 在應(yīng)用該“納米酶”體系進(jìn)行夾心法檢測(cè)DNA的實(shí)驗(yàn)中，首先在親和素包被的磁性微粒(magneticmicroparticles，MMPs)表面組裝上生物素修飾的DNA捕獲探針，通過(guò)與靶DNA序列的雜交作用捕獲游離在檢測(cè)樣品溶液中的靶DNA，經(jīng)過(guò)磁性分離對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行富集之后，再與納米酶進(jìn)行雜交反應(yīng)。洗脫非特異的吸附之后，加入顯色底物ABTS(2，2’-Azino—bis(3

3、-Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonic Acid))或熒光底物HPPA(3-(4-Hydroxyphenyl)propionic acid)進(jìn)行酶催反應(yīng)。 結(jié)果表明，反應(yīng)后產(chǎn)物溶液的光吸收值或者熒光強(qiáng)度與靶DNA的濃度在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。由于一個(gè)納米金顆粒上可以結(jié)合多個(gè)DNA和HRP分子，起到了信號(hào)放大的作用，且磁性微粒起到了濃縮樣品、富集靶物質(zhì)的作用，這種檢測(cè)方法顯示出良好的靈敏度和可重現(xiàn)性

4、。采用顯色底物反應(yīng)，根據(jù)酶催反應(yīng)產(chǎn)物在405nm處的吸光值繪制工作曲線，該方法對(duì)靶DNA的最低檢測(cè)限在30pM左右，有效檢測(cè)范圍大約在100pM至3nM之間；采用熒光底物反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在激發(fā)波長(zhǎng)320nm,發(fā)射波長(zhǎng)405nm條件下測(cè)得熒光強(qiáng)度，結(jié)果能夠?qū)z測(cè)極限降低到3pM左右，且具有更大的檢測(cè)范圍，大約在10pM至IOnM之間。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，這種應(yīng)用“納米酶”的雜交檢測(cè)體系表現(xiàn)出良好的特異性，用不能與探針互補(bǔ)的DNA作為陰性對(duì)照，與含