核酸探針與光學(xué)生物傳感的新方法研究.pdf

1、生物傳感器作為快速靈敏檢測(cè)生物分子的工具一直以來(lái)都是生命科學(xué)和分析化學(xué)領(lǐng)域十分關(guān)注的課題。光學(xué)傳感技術(shù)因具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、無(wú)需分離、可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物分子的檢測(cè)，如酶活性、蛋白質(zhì)、核酸和生物小分子等。此外，核酸探針因其序列多變、識(shí)別多樣化、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)在生物傳感與生化分析新方法建立方面引起了廣泛的關(guān)注。在大量文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上，本文結(jié)合多種構(gòu)型的核酸探針和光學(xué)分析方法構(gòu)建了幾種光學(xué)生物傳感新方法用于檢測(cè)聚核苷酸激酶

2、(PNK)活性，miRNA以及與致病基因相關(guān)的DNA序列。與傳統(tǒng)方法比較，所建立的傳感策略操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，檢測(cè)成本低，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)測(cè)定。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)依賴于磷酸化的DNA連接反應(yīng)，我們構(gòu)建了一種無(wú)標(biāo)記的生物發(fā)光傳感器用于PNK活性的檢測(cè)。在該傳感策略中，設(shè)計(jì)了兩個(gè)帶有5’突出端的發(fā)夾 DNA探針作為磷酸化受體，同時(shí)廣泛應(yīng)用的磷酸供體ATP被dCTP取代。當(dāng)不存在PNK時(shí)，由于發(fā)夾探針5’端缺乏磷酸基團(tuán)而

3、不能引發(fā)連接反應(yīng)，顯示出較弱的背景信號(hào)。加入PNK時(shí)，使兩探針發(fā)生磷酸化而引發(fā)連接反應(yīng)，同時(shí)釋放出 AMP，隨后將 AMP轉(zhuǎn)換為 ATP，在熒光素酶作用下產(chǎn)生明顯的生物發(fā)光信號(hào)，通過(guò)生物發(fā)光信號(hào)的連續(xù)監(jiān)測(cè)可實(shí)現(xiàn)PNK活性的實(shí)時(shí)檢測(cè)。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，無(wú)需標(biāo)記，成本低廉，免受生物基質(zhì)自身熒光的干擾，還可以進(jìn)一步用于PNK的定量、動(dòng)力學(xué)及抑制劑研究。⑵基于目標(biāo)分子引發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)輔助的連接反應(yīng)，通過(guò)生物發(fā)光法檢測(cè)連接反應(yīng)釋放出的

4、AMP，發(fā)展了一種新的高靈敏的miRNA均相檢測(cè)方法。當(dāng)存在靶miRNA時(shí)，它可有效的引發(fā)兩發(fā)夾探針之間的HCR，形成帶有切口的長(zhǎng)鏈DNA聚合物，這些切口可被連接酶共價(jià)連接，釋放出AMP產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)miRNA的定量分析。HCR的引入不僅提高了檢測(cè)的靈敏度，而且通過(guò)核酸探針的特殊設(shè)計(jì)可為其它生物分子的檢測(cè)提供潛在平臺(tái)。重要的是，生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)以靶依賴連接副產(chǎn)物AMP轉(zhuǎn)換的ATP作為報(bào)告基團(tuán)，無(wú)需復(fù)雜的熒光素酶標(biāo)記、固定、分離等步驟

5、。該方法具有操作簡(jiǎn)單，成本低廉，高通量，高靈敏等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際檢測(cè)中有很大的應(yīng)用價(jià)值。⑶將納米金的重力和聚合酶的識(shí)別作用相結(jié)合，構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單的熒光傳感方法用于靶DNA序列檢測(cè)，并選用與致病基因相關(guān)的p53序列為模型。首先，將巰基修飾的引物通過(guò)S-Au自組裝到AuNP上，當(dāng)存在目標(biāo)DNA時(shí)，探針與目標(biāo)DNA的部分序列雜交，生成的不對(duì)稱產(chǎn)物在Taq DNA聚合酶和dNTPs的輔助下，延伸形成穩(wěn)定的dsDNA螺旋結(jié)構(gòu)。最后，在連接酶的作用下將