基因檢測和點突變識別的DNA探針及適配體生物傳感新方法研究.pdf

1、隨著人類基因組計劃的完成和功能蛋白質組學的研究進展，建立簡單、靈敏、快速、特異性強、高通量的蛋白質和基因檢測方法，已成為分析科學家們研究的重點之一。核酸堿基的突變與人類許多疾病有著直接的關系，因此實現(xiàn)單核苷酸突變準確靈敏的檢測對疾病的早期診斷也有著重要的意義。核酸適配體是近年來發(fā)展起來的一類經(jīng)體外人工進化程序篩選出的寡聚核苷酸。 由于其不但和抗體一樣能與配體高效、特異性地結合，而且具有許多抗體無法比擬的優(yōu)點，因此將核酸適配體應

2、用于生物傳感器實現(xiàn)對包括蛋白質、小分子等目標物的檢測有著巨大的發(fā)展?jié)摿Α?鑒于電化學及壓電檢測技術所需儀器簡單、檢測成本低、易于實現(xiàn)微型化，且靈敏度較高等優(yōu)點，本研究論文針對當前傳感器設計中的探針固定化和檢測方法兩個關鍵技術，在電化學及壓電DNA傳感器用于基因檢測和點突變識別以及電化學適配體傳感器兩方面開展了一些新方法研究工作。具體內容如下： (1)在第2章中，研制出一種新型的基于納米多孔CeO2/殼聚糖復合膜的固定

3、基質。用它來固定單鏈DNA探針，構建了檢測與結腸癌高度相關的基因序列的電化學DNA生物傳感器。該固定基質制備方法簡單，成本低，結合了CeO2和殼聚糖的優(yōu)點，具有良好的生物兼容性，無毒性和優(yōu)越的電子傳導性。將其用于固定結腸癌基因的互補探針序列，能夠顯著增強ssDNA探針在電極表面的負載量。制得的傳感器檢測目標的線性范圍在1.6×10-11-1.2×10-7M，檢測下限為1.0×10-11 M，具有識別完全互補目標序列和四堿基錯配序列的能力

4、。 (2)在第3章中，基于連接酶的高保真性和生物催化沉積反應，提出了用于高特異性識別單堿基突變的壓電檢測方法。實驗中，目標DNA鏈先與連接在石英晶振上的DNA捕獲探針雜交，再與生物素標記的等位特異性DNA檢測探針雜交。只有在目標DNA鏈和檢測探針完全匹配時，連接反應才能發(fā)生，即將捕獲探針和檢測探針相連接。否則，即使只有一個等位錯配的基因，連接反應也不會發(fā)生。經(jīng)過高溫熱處理，形成的雙鏈解開，只有與目標鏈完全匹配的檢測探針保留在電

5、極表面。生物素化的檢測探針繼而與鏈酶親和素化的辣根過氧化物(SA-HRP)綁定，辣根過氧化物催化過氧化氫氧化底物中的3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)在電極表面生成不溶性沉淀物，使壓電頻率響應顯著增大。用該方法對β-地中海貧血基因-28位密碼子的突變情況進行了檢測，使突變型和野生型得到了很好的區(qū)分，對目標的檢測線性范圍為0.7-100 nM，檢測下限達0.1 nM，是一個低成本高效率的檢測方法。 (3)在第4章中，基于等位基因特異

6、性延伸法，結合酶催化銀沉積的放大體系，提出了用于單堿基突變的電化學檢測方法。首先，在金電極表面固定的等位特異性捕獲探針。由于其與野生型目標鏈完全互補，在聚合酶的作用下能夠發(fā)生延伸反應；而突變型目標鏈由于3’端與捕獲探針發(fā)生錯配，延伸反應不能進行，從而實現(xiàn)對突變型和野生型基因的區(qū)分。用1 M NaOH進行解鏈處理后，雙鏈結構解開，目標鏈從電極表面脫落。在電極表面滴加與探針延伸部分相互補的生物素化的檢測探針后，只有發(fā)生延伸反應的捕獲探針鏈會

7、進一步與生物素化的檢測探針雜交，并引入鏈親和素化的堿性磷酸酶，繼而發(fā)生酶催化沉積銀的反應。通過線性掃描伏安法可以檢測出電極表面沉積的銀。該方法成功用于β-地中海貧血基因-28位密碼子單堿基突變的區(qū)分和定量檢測，簡單、快速、靈敏度高，線性范圍為3.0×10-16-3.0×10-8M，檢測下限為1.0×10-16M。 (4)在第5章中，報道了基于目標物誘導置換適配體的無標記電化學傳感器，用于以腺苷為分析物模型的目標物檢測。該傳感器

8、使用1，6-巰基己醇自組裝層修飾的金電極為傳感基底，以巰基己醇為媒介組裝金納米顆粒層，能夠增加巰基捕獲探針的表面負載量，提高信號強度。含有腺苷適配體序列的一段寡核苷酸序列一部分可與捕獲探針雜交，在電極表面形成捕獲探針與適配體的雙鏈復合物。含有腺苷的分析物的加入，把腺苷適配體序列置換下來，使其從電極表面解離，從而減少了電極表面核酸鏈的數(shù)量，使與核酸作用的電化學活性指示劑亞甲基藍的量相應減少。指示劑的還原電流的大小能夠反映被分析物的濃度。構

9、造的傳感器簡單、快速、靈敏、選擇性好，線形范圍為5.1000 nM，檢測下限為1 nM，同時具有簡便快速的再生能力。 (5)在第6章中，報道了基于抗體與生物素標記的適配體新型夾心的酶放大電化學免疫傳感器，用于免疫球蛋白E(IgE)的檢測。IgE多克隆抗體作為捕獲探針通過半胱胺自組裝層以及交聯(lián)劑戊二醛的作用共價固定在金電極表面，與目標物發(fā)生免疫反應后，繼續(xù)捕獲生物素化的IgE適配體的檢測探針，從而形成一種新型的夾心結構。之后，通

10、過生物素與親和素的特異性親和作用，親和素標記的堿性磷酸酯酶能與電極表面適配體上的生物素相結合，促使堿性磷酸酯酶催化底物抗壞血酸磷酸酯水解成強還原劑抗壞血酸，并將底液中的銀離子還原成單質銀，沉積到電極表面。沉積的銀的量與電極表面捕獲的目標IgE的量成正比，可以用溶出伏安法來定量。結果表明，該免疫傳感器結合了抗體和適配體的雙重特異性，并利用了酶催化銀沉積體系的高靈敏性，檢測目標蛋白的靈敏度高、特異性好，線性范圍為0.1-100 nM，檢測下

11、限為0.02 nM。 (6)第7章，同樣基于抗體與適配體的新型夾心結構，構建了納米金/殼聚糖電化學沉積復合膜的新型固定基質用于抗體的固定，采用亞甲基藍為電活性指示劑，報道了檢測凝血酶的無標記電化學方法。該復合膜結合了納米金和殼聚糖獨特的性能，提高了傳感器的導電性能以及負載量。實驗考察了納米金/殼聚糖電化學沉積條件，并用掃描電子顯微鏡對該膜進行了表征。 在這個工作中，在不改變適配體與目標物結合作用的基礎上，對原凝血酶的