生物分子化學(xué)發(fā)光檢測(cè)新方法研究.pdf

1、核酸和蛋白質(zhì)等生物分子的檢測(cè)是目前藥物分析、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、微生物檢驗(yàn)等領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，檢測(cè)方法包括有電化學(xué)法、分光光度法、熒光法、同位素法和化學(xué)發(fā)光法(CL)等。不同方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中同位素法最為成熟，但存在一定的環(huán)境污染，對(duì)人的健康具有一定的損害。為替代同位素法，其它的非放射性技術(shù)，如有電化學(xué)法，酶法，熒光法，CL法等在近年來(lái)發(fā)展迅速。
　　CL分析法不需光源，儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便，具有極高的靈敏度，已成為近年來(lái)一

2、個(gè)非?；钴S的研究領(lǐng)域，目前已成功地應(yīng)用在藥學(xué)、化學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和環(huán)境學(xué)等諸多領(lǐng)域。為此，本論文采用CL分析法，利用金納米粒子放大技術(shù)，模板識(shí)別技術(shù)和適配體技術(shù)，發(fā)展了多種具有創(chuàng)新意義的處理CL檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)生物分子的簡(jiǎn)單快速、高靈敏度和高選擇性檢測(cè)，整個(gè)論文由以下四部分構(gòu)成:
　　第一章:緒論
　　緒論由兩節(jié)構(gòu)成，其中第一節(jié)簡(jiǎn)單介紹了多種信號(hào)放大技術(shù)在生物分子檢測(cè)領(lǐng)域的研究進(jìn)展及其意義，主要內(nèi)容包括:納米粒子放

3、大技術(shù)，酶放大技術(shù)，雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大技術(shù)和滾環(huán)擴(kuò)增放大技術(shù)等，并列舉了近年來(lái)它們?cè)谠摲治鲱I(lǐng)域的部分典型示例;第二節(jié)闡述了本博士論文的研究目的、意義、主要內(nèi)容及創(chuàng)新之處。
　　第二章:基于金納米粒子的生物分子化學(xué)發(fā)光檢測(cè)新技術(shù)
　　金納米粒子是一種理想的生物標(biāo)記物，制備工藝簡(jiǎn)單，性質(zhì)穩(wěn)定，且固定在金納米粒子表面的生物分子仍能保持原有的生物活性，因此被廣泛地應(yīng)用在生物分子檢測(cè)等研究領(lǐng)域。我們發(fā)現(xiàn):金納米粒子和汞離子都能催化羥胺-

4、氯金酸反應(yīng)，使金納米粒子粒徑增大或原位合成汞離子為核的金納米粒子，隨后催化魯米諾-硝酸銀(AgNO3)反應(yīng)，產(chǎn)生CL信號(hào)。基于這個(gè)原理，我們建立了兩種檢測(cè)方法:一種采用金納米粒子作為標(biāo)記物，建立了夾心反應(yīng)模式的特定序列DNACL檢測(cè)方法，隨后通過(guò)羥胺-氯金酸反應(yīng)增大了金納米粒子的粒徑，得以放大CL信號(hào)，大幅提高了檢測(cè)靈敏度，如通過(guò)兩次放大，檢測(cè)限可達(dá)300 aM;另一種以核酸T堿基作為捕獲探針，捕獲汞離子后催化羥胺-氯金酸反應(yīng)原位合成金

5、納米粒子，加入底物后產(chǎn)生CL信號(hào)，建立了汞離子的CL檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)單快速，對(duì)汞離子特異性高，靈敏度達(dá)10 ppt，達(dá)到美國(guó)EPA要求的最新汞離子檢出限。
　　第三章:基于模板識(shí)別的生物分子化學(xué)發(fā)光檢測(cè)新技術(shù)
　　本章建立了一種基于模板識(shí)別的DNA和蛋白質(zhì)的CL檢測(cè)新技術(shù)。模板識(shí)別模式是將報(bào)告探針作為模板，在沒(méi)有目標(biāo)分子的情況下，報(bào)告探針與捕獲探針之間的互補(bǔ)堿基不足以形成穩(wěn)定的雙鏈;只有當(dāng)目標(biāo)分子出現(xiàn)時(shí)，報(bào)告探針才能與捕獲

6、探針形成穩(wěn)定的雙鏈固定在載體上，產(chǎn)生CL信號(hào)。在第一節(jié)中，我們突破了傳統(tǒng)夾心法的限制，采用模板識(shí)別模式，建立了一種適合短鏈DNA的CL檢測(cè)方法。在該方法中，報(bào)告序列作為模板序列，只有在目標(biāo)DNA存在的情況下，才能與具有8個(gè)堿基的捕獲探針互補(bǔ)雜交，生成穩(wěn)定的雜交復(fù)合物，產(chǎn)生CL信號(hào)。該方法簡(jiǎn)單、快速，靈敏度可以達(dá)到10 amol，并且很容易拓展到多組分同時(shí)測(cè)定。在第二節(jié)中，我們將模板識(shí)別技術(shù)與適配體技術(shù)相結(jié)合，將適配體設(shè)計(jì)成報(bào)告探針，實(shí)現(xiàn)

7、了蛋白質(zhì)的簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)。在本方法中，只有當(dāng)目標(biāo)蛋白PDGF存在時(shí)，報(bào)告探針中的適配體將識(shí)別PDGF并發(fā)生構(gòu)象變化，提供足夠的堿基堆積力使報(bào)告探針與捕獲探針形成穩(wěn)定的雙鏈固定到96孔板上，之后結(jié)合標(biāo)記物后產(chǎn)生CL信號(hào)，而在沒(méi)有目標(biāo)蛋白PDGF存在的情況下，報(bào)告探針與捕獲探針不能穩(wěn)定結(jié)合。本節(jié)所構(gòu)建的CL適配體檢測(cè)新技術(shù)，PDGF的檢測(cè)靈敏度可達(dá)10fM，且不需要使用抗體，應(yīng)用范圍廣，能夠很容易拓寬至其它具有適配體的蛋白質(zhì)如凝血酶甚至小分

8、子如腺苷、可卡因的檢測(cè)。
　　第四章:基于構(gòu)象轉(zhuǎn)化的免標(biāo)記miRNA化學(xué)發(fā)光適配體檢測(cè)技術(shù)
　　本章結(jié)合適配體技術(shù)和分子信標(biāo)技術(shù)，提出了一種具有創(chuàng)新意義的變構(gòu)分子信標(biāo)技術(shù)。第一節(jié)以鏈霉親合素適配體-分子信標(biāo)的構(gòu)象轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)，構(gòu)建了一種具有創(chuàng)新意義的基于磁性分離和適配體構(gòu)象轉(zhuǎn)化的免標(biāo)記miRNA CL檢測(cè)新技術(shù)，同時(shí)引入了雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大技術(shù)，大幅提高了檢測(cè)的靈敏度。第二節(jié)將酶循環(huán)放大的方法引入到miRNA的檢測(cè)當(dāng)中，采用DN