基于碳基納米材料-魯米諾的電致化學(xué)發(fā)光生物酶?jìng)鞲行路椒ㄑ芯?pdf

1、本論文首先綜述電致化學(xué)發(fā)光的基本原理、常見(jiàn)的反應(yīng)類型及常用的發(fā)光試劑和納米材料參與電化學(xué)發(fā)光構(gòu)建生物傳感的現(xiàn)狀。石墨烯量子點(diǎn)作為一種新型電化學(xué)發(fā)光試劑，在構(gòu)建生物傳感方面也表現(xiàn)出良好的特性?；贓CL-RET技術(shù)已應(yīng)用于DNA、細(xì)胞傳感及免疫分析等領(lǐng)域。基于此，本論文以電化學(xué)發(fā)光方法構(gòu)建生物傳感為目標(biāo)，利用納米材料信號(hào)增強(qiáng)作用，構(gòu)建新型電化學(xué)發(fā)光生物傳感器分別用于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和蛋白激酶的檢測(cè)，進(jìn)一步開(kāi)展了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和蛋白激酶對(duì)

2、應(yīng)抑制劑的篩選等相關(guān)研究，主要包括以下兩個(gè)方面的工作：
　　1.成功合成了具有電化學(xué)發(fā)光特性的GO/AgNPs/luminol復(fù)合物用于構(gòu)建新型Dam MTase活性檢測(cè)的ECL傳感器。首先，在氧化石墨烯表面以luminol為還原劑還原硝酸銀（AgNO3）為 AgNPs，成功制備了具有電化學(xué)發(fā)光特性的GO/AgNPs/luminol復(fù)合物，接著加入炔丙胺后通過(guò) Ag-N鍵形成炔基功能化的GO/AgNPs/luminol復(fù)合物，在C

3、u(I)催化下炔基化合物與疊氮化合物發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)將 GO/AgNPs/luminol復(fù)合物組裝在疊氮修飾 dsDNA的電極表面，在共反應(yīng)劑H2O2存在時(shí)產(chǎn)生luminol的強(qiáng)電致化學(xué)發(fā)光（ECL）；將該電極浸入DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Dam）溶液中，含5′-GATC-3′序列的dsDNA發(fā)生甲基化，而后被甲基化限制性內(nèi)切酶Dpn I剪切，使得部分GO/AgNPs/luminol復(fù)合物從電極表面脫落下來(lái)，導(dǎo)致 luminol的ECL信號(hào)下降。G

4、O/AgNPs/luminol的ECL減少與Dam濃度呈正相關(guān)。因此，可通過(guò)ECL信號(hào)的變化檢測(cè)Dam的活性，對(duì)Dam檢測(cè)的線性范圍為0.1-20 U/mL，檢測(cè)限為0.03 U/mL。本方法還可用于Dam抑制劑的篩選，從5-氟尿嘧啶對(duì)應(yīng)的ECL響應(yīng)曲線計(jì)算得到IC50值為18.2μM。
　　2.以石墨烯量子點(diǎn)（GQDs）和魯米諾（luminol）分別為陰極和陽(yáng)極ECL發(fā)光試劑，建立了雙電位比率ECL傳感平臺(tái)，用于檢測(cè)蛋白激酶活性

5、及抑制劑篩選。首先，將羧基化的GQDs通過(guò)共價(jià)鍵合作用組裝在殼聚糖修飾電極表面，通過(guò)酰胺作用使多肽連接在電極表面，在巰基三磷酸腺苷（ATP-s）和蛋白激酶（PKA）的作用下，多肽發(fā)生磷酸化，進(jìn)而通過(guò)Au-S鍵作用將Au NPs捕獲于巰基磷酸化多肽修飾電極表面。以H2O2為共反應(yīng)劑時(shí)，GQDs和靠近電極表面的Au NPs發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移使GQDs的陰極ECL強(qiáng)度下降，同時(shí)，該Au NPs促進(jìn)了luminol在電極表面的電子傳遞而使得lum

6、inol的陽(yáng)極ECL強(qiáng)度上升。在同一體系中，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了GQDs的陰極ECL減小和luminol的陽(yáng)極ECL增強(qiáng)。隨著激酶濃度的增加，更多的Au NPs被捕獲于電極上，使得對(duì)luminol的ECL反應(yīng)有更高的電催化活性，同時(shí)與GQDs有更強(qiáng)的ECL能量共振轉(zhuǎn)移。因此，luminol的ECL增加程度與GQDs的ECL減小程度的比值與PKA活性呈正相關(guān)，對(duì)PKA檢測(cè)的線性范圍為0.01-10 U/mL，檢測(cè)限為0.005U/mL。本方法還可用