基于金屬納米材料及酶構(gòu)建電致化學(xué)發(fā)光適配體傳感器的研究.pdf

1、電致化學(xué)發(fā)光適配體傳感器是以適配體為分子識別元件，利用固定化方法將參與電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的試劑固定在傳感器表面，然后通過測定其發(fā)光強度完成對待測物定量檢測的一類新分析器件。它將電致化學(xué)發(fā)光技術(shù)與適配體的高特異性和親和性融合在一起，具有高靈敏度、高選擇性、低背景信號等特點.本文擬以復(fù)合納米材料為載體，通過吸附、交聯(lián)等固定化方法增加直接或者間接參與電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的試劑固載量，從而構(gòu)建簡單、可靠、快速、高靈敏度的信號增強型(signalon)和信

2、號減小型(signaloff)電致化學(xué)發(fā)光適配體傳感器用于凝血酶的檢測.本文所做的研究工作包括以下幾個部分:
　　 1、基于納米金和L-Cys催化放大聯(lián)吡啶釕電致化學(xué)發(fā)光構(gòu)建凝血酶適體傳感器的研究
　　 分子自組裝膜具有類似生物膜的特性，且穩(wěn)定性較高，現(xiàn)已成為電化學(xué)及電分析化學(xué)研究領(lǐng)域的一個熱點。在該研究體系中，我們利用電聚合的方法將L-Cys自組裝在電極表面以促進電子傳遞及增強電致化學(xué)發(fā)光效率，再通過電沉積一層納米金，

3、用于固載修飾有巰基的凝血酶適體鏈.此時，利用雜交互補配對將標記有氨基化聯(lián)吡啶釕(Ru-NH2)的凝血酶互補鏈修飾在電極表面，由于納米金和L-Cys對Ru-NH2發(fā)光的增強作用，傳感器在硼酸緩沖溶液中檢測表現(xiàn)出較強的電致化學(xué)發(fā)光信號.當傳感器與目標物凝血酶結(jié)合時，傳感器表面的凝血酶適體捕獲目標分子后迫使氨基聯(lián)吡啶釕標記的凝血酶互補鏈離開電極表面，同時電極表面空間位阻增大，因此得到減弱的電致化學(xué)發(fā)光信號。我們就可以根據(jù)電致化學(xué)發(fā)光信號的降低

4、來定量檢測凝血酶的濃度.從實驗的結(jié)果來看，所設(shè)計的適體傳感器具有較高的靈敏度，檢測范圍為1×10-12～1.5×10-8mol/L，檢出限為0.3pmol/L(S/N=3).
　　 2、基于4-(二甲基氨基）丁酸和鉑納米顆粒促進聯(lián)吡啶釕電致化學(xué)發(fā)光構(gòu)建凝血酶適體傳感器的研究
　　 4-（二甲基氨基）丁酸(DMBA)和鉑納米顆粒(PtNPs)對聯(lián)吡啶釕發(fā)光具有很強的催化作用。我們基于目標物誘導(dǎo)適體鏈置換反應(yīng)，以4-(二甲基

5、氨基)丁酸(DMBA)和鉑納米顆粒(PtNPs)為增強劑，成功構(gòu)建了高靈敏電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器.該適體傳感器主要包括三個部分:固態(tài)ECL響應(yīng)平臺，發(fā)光強度放大和目標物誘導(dǎo)的適體鏈置換反應(yīng)。固態(tài)ECL響應(yīng)平臺是將納米鉑和三聯(lián)吡啶釕(Ru(bpy)32+)所形成的復(fù)合物(Ru-PtNPs)通過靜電吸附作用修飾在Nafion分散的多壁碳納米管（nafion@MWCNTs）電極表面，然后將凝血酶適體與DMBA@PtNPs標記的凝血酶適體互補鏈

6、（AptamerⅡ）所形成的雙鏈(TBA-AptamerⅡ)組裝在修飾的電極表面以增大發(fā)光強度。當傳感器與目標物凝血酶結(jié)合時，AptamerⅡ的復(fù)合物從雜交鏈上置換下來釋放到溶液中，惰性的凝血酶蛋白組裝到電極表面。適體傳感器上DMBA@PtNPs量的減少以及結(jié)合的凝血酶對電子傳遞阻礙作用引起了ECL強度的急劇降低。由于DMBA和PtNPs對Ru(bpy)32+的ECL信號的協(xié)同放大作用，所構(gòu)建的適體傳感器在孵育凝血酶前后有明顯的ECL信

7、號差異，顯著提高了傳感器的靈敏度。實驗結(jié)果表明，ECL信號的改變與凝血酶濃度的對數(shù)在0.001～30nmol/L的范圍內(nèi)成線性關(guān)系，檢出限達到0.4pmol/L。該傳感器有望被廣泛用于臨床和生物分析中對蛋白質(zhì)檢測。
　　 3、基于二茂鐵標記的分子信標猝滅聯(lián)吡啶釕電致化學(xué)發(fā)光構(gòu)建凝血酶適體傳感器的研究
　　 β-環(huán)糊精(β-CD)有著錐形的中空圓筒立體環(huán)狀結(jié)構(gòu)，它的外體和腔體分別具有親水性和疏水性，這使得環(huán)糊精可以作為主體

8、去容納相應(yīng)的客體并改變其物理化學(xué)性質(zhì)。利用這個特性，我們構(gòu)建了二茂鐵標記的分子信標猝滅聯(lián)吡啶釕的電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器用于凝血酶的定量檢測。在該實驗體系中，Nafion分散的多壁碳納米管(CNTs/Nafion)作為固載基質(zhì)首先修飾在電極表面，然后把β-環(huán)糊精與Ru(bpy)32+形成的復(fù)合物通過靜電吸附作用修飾在CNTs/Nafion膜電極表面。這里，我們采用分子識別技術(shù)，將一端修飾有二茂鐵(Fc)的凝血酶適體分子信標作為目標物分子識

9、別探針。在孵育目標物凝血酶后，致使分子信標結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，二茂鐵(Fc)與β-環(huán)糊精(β-CD)結(jié)合，有效地猝滅了Ru(bpy)32+的ECL。根據(jù)ECL發(fā)光強度的降低我們就可以完成對凝血酶的定量檢測.本實驗設(shè)計的傳感器對目標物的檢測范圍為0.1pmol/L～20nmol/L,檢測限達0.03pmol/L(3σ).
　　 4、原位產(chǎn)生脯氨酸促進聯(lián)吡啶釕電致化學(xué)發(fā)光構(gòu)建超靈敏適體傳感器研究
　　 原位產(chǎn)生共反應(yīng)試劑可有效增強

10、電致化學(xué)發(fā)光強度，提高檢測靈敏度。在該體系中，我們利用含有大量叔氨基團的樹枝狀聚合物PAMAM固載Ru-PtNPs以增大其固載量，然后利用生物素與PtNPs之間的作用將生物素標記的脯氨酸肽酶(GDPA)修飾在其表面。通過生物素和親和素的橋聯(lián)作用固載親和素標記的凝血酶適體鏈以形成第二適體。最后采用夾心式模式構(gòu)建了原位產(chǎn)生脯氨酸(Pro)，由于Pro是一種仲胺類物質(zhì)，可以催化聯(lián)吡啶釕及其衍生物的電致化學(xué)發(fā)光，因此，在檢測底液中加入底物甘氨酸

11、-D-脯氨酸(GDP)之后，電極表面的GDPA催化其原位產(chǎn)生Pro，有效地提高了聯(lián)吡啶釕的電致化學(xué)發(fā)光強度，從而達到靈敏檢測目標物的目的。實驗結(jié)果表明該傳感器對凝血酶的檢測范圍為1×10-14～1×104mol/L，檢出限為3.3fmol/L。5基于3，4，9，10-苝四甲酸二酐功能化石墨烯標記適體構(gòu)建過硫酸根電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的研究
　　 我們以3，4，9，10-苝四甲酸二酐(PT℃DA)功能化的石墨烯復(fù)合物作為一種新型的

12、標記物標記凝血酶適體(TBA)以形成第二適體鏈(AptⅡ)，然后通過夾心反應(yīng)成功地構(gòu)建了超靈敏的電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器用于凝血酶的定量檢測。石墨烯較大的比表面積為PTCDA和TBA的大量固載提供了好的穩(wěn)定性和生物相容性。此外，石墨烯具有良好的電子傳導(dǎo)能力，與具有良好光學(xué)性能的PTCDA形成的生物共軛物可以有效催化放大過硫酸根(S2O82-)的電致化學(xué)發(fā)光信號，從而在檢測凝血酶時得到1fmol/L到1nmol/L的較寬檢測范圍和0.33f