基于發(fā)光納米材料構(gòu)建的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器應(yīng)用于心肌肌鈣蛋白-I檢測.pdf

1、隨著納米材料迅速的發(fā)展，在納米材料表面富集大量電致化學(xué)發(fā)光（ECL）活性分子合成發(fā)光功能化納米材料，以及研究具有ECL性質(zhì)的自發(fā)光納米材料，受到人們的廣泛關(guān)注。我們將發(fā)光納米材料作為信號(hào)探針，構(gòu)建高選擇性、高靈敏度、低背景的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器分析方法。
　　急性心肌梗塞（AMI）是臨床常見的急性多發(fā)病，正確診斷及時(shí)救治對挽救瀕死心肌，對改善和降低 AMI患病率和死亡率具有重要意義。心肌肌鈣蛋白（cardiac troponin

2、，cTn）是心肌肌肉收縮的調(diào)節(jié)蛋白。其中心肌肌鈣蛋白I（cTnI）的分泌和心肌梗塞發(fā)病率密切相關(guān)，在醫(yī)學(xué)檢測中cTnI被認(rèn)為是心肌梗塞檢測的黃金標(biāo)準(zhǔn)心臟生物標(biāo)記物。
　　我們將ECL免疫傳感器的特性和納米材料特有的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合用于實(shí)現(xiàn)在患病的早期階段高效、低濃度、快速的cTnI測定。該方法不僅無需復(fù)雜繁瑣的試劑加入過程，操作過程簡單，還縮短了能量傳遞過程，減少能量損失成功地實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)分析物的高靈敏、低成本檢測，成為生物分析領(lǐng)域一個(gè)新的

3、發(fā)展趨勢。
　　本論文主要從以下幾個(gè)方面開展研究工作：
　　1.基于自增強(qiáng)釕(II)復(fù)合物的超靈敏電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于檢測cTnI
　　傳統(tǒng)的ECL免疫傳感器為了提升發(fā)光試劑的發(fā)光效率通常將共反應(yīng)試劑加在檢測底液中，但溶液中許多不利的微環(huán)境因素限制了ECL分析技術(shù)的檢測靈敏性。在本工作中，我們將共反應(yīng)試劑（L-cysteine）和發(fā)光試劑（Ru(dcbpy)32+）連接在一個(gè)分子上獲得一種新穎的自增強(qiáng) ECL發(fā)光

4、試劑（L-cys@Ru(II)）。自增強(qiáng)釕(II)復(fù)合物的應(yīng)用不僅避免了將共反應(yīng)試劑和發(fā)光試劑添加于測試底液中，簡化了測定過程、縮短了分析時(shí)間，同時(shí)實(shí)現(xiàn)分子內(nèi)反應(yīng)縮短了能量傳遞路徑、減少了能量損失，有效的提高了ECL發(fā)光信號(hào)。隨后，釕(II)復(fù)合物和二抗（anti-cTnI）通過Au-N或Au-S共價(jià)鍵被固載在金納米棒（AuNRs）上，這不僅實(shí)現(xiàn)更多自增強(qiáng)釕(II)復(fù)合物的固載，還合成了穩(wěn)定的Ab2生物復(fù)合物作為信號(hào)探針。最后，ECL免

5、疫傳感界面的構(gòu)建是通過電化學(xué)沉積樹枝狀金納米粒子（GNDs）在玻碳電極（GCE）表面來固載捕獲抗體（anti-cTnI）。目標(biāo)傳感器展示出高的靈敏度和寬的線性范圍，cTnI的檢測線性范圍為0.25pg/mL～0.1ng/mL，檢出限為0.083pg/mL(S/N=3)。該方法具有制備簡單、操作簡便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，為臨床免疫測定法提供了新的參考。
　　2.基于膽堿氧化酶和魯米諾還原的Pt@Au雜交納米花的雙重放大體系的超靈敏免疫分

6、析
　　魯米諾作為一種廣泛研究的ECL發(fā)光試劑，具有，低氧化電位、高發(fā)光效率和強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度的優(yōu)點(diǎn)。近年來，眾多課題組一直在尋找合適的方式將魯米諾固載在電極表面用于生物檢測。本工作中，首先利用魯米諾的還原性合成多功能的Pt和Au雜化的花狀納米復(fù)合物，同時(shí)在還原反應(yīng)中發(fā)光基團(tuán)魯米諾連接在納米復(fù)合物上形成納米復(fù)合物（luminol-Pt@AuNF）；隨后膽堿氧化酶（ChOx）通過Pt-N或Pt-S共價(jià)鍵被固載在納米復(fù)合物的表面，從而構(gòu)建了

7、包括ChOx催化膽堿生成H2O2和H2O2被Pt@AuNFs模擬酶原位催化分解的雙重模擬酶放大體系，形成的H2O2被Pt@AuNFs模擬酶催化分解為OH·和O2·?直接催化促進(jìn)魯米諾的ECL發(fā)光，顯著的增強(qiáng)了傳感器的靈敏度；最后，我們采用MnO2功能化的碳納米管（MnO2@MWNTs）來固載Ab1修飾免疫傳感界面。綜上所述，目標(biāo)免疫傳感器對cTnI的線性范圍寬（0.05pg mL-1～0.1ng mL-1）、檢出限低（83fg mL-1

8、）、選擇性高、重現(xiàn)性好，對cTnI檢測限達(dá)到fg mL-1級(jí)別，在免疫測定領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　3.基于銀納米晶和Ru(bpy)32+之間的雙波長比率法共振能量轉(zhuǎn)移電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于心肌肌鈣蛋白I檢測
　　本工作中，通過簡易的電沉積法直接在電極表面合成銀納米簇（AgNCs），并首次觀察到AgNCs在 nm波長有顯著的陰極ECL發(fā)光。我們通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM），X射線衍射（XRD），以及熒光光譜（

9、PL），表征了AgNCs的形態(tài)特征，并探討了其光學(xué)性質(zhì)。并采用過二硫酸離子（S2O82-）促進(jìn)AgNCs的ECL發(fā)光，通過共反應(yīng)試劑路徑闡明AgNCs的ECL發(fā)光機(jī)制。相較于在溶液中傳統(tǒng)的AgNCs，我們制備的AgNCs采用一個(gè)簡單而快速的電沉積方法合成，并產(chǎn)生了高發(fā)光效率。但是AgNCs的ECL效率低于魯米諾、聯(lián)吡啶釕等傳統(tǒng)的ECL試劑的發(fā)光效率，同時(shí)AgNCs的ECL激發(fā)電位過高，這限制了AgNCs的生物檢測應(yīng)用。我們設(shè)計(jì)了基于從A

10、gNCs到聯(lián)吡啶釕（Ru(bpy)32+）之間的雙波長比率法電致化學(xué)發(fā)光能量轉(zhuǎn)移（ECL-RET）免疫傳感器用于cTnI的靈敏檢測。AgNCs的ECL激發(fā)波長與Ru(bpy)32+的紫外-可見吸收峰顯示了良好的光譜重疊，說明基于ECL信號(hào)在458nm處淬滅并在650nm處增強(qiáng)可實(shí)現(xiàn)雙波長比率法ECL-RET。最后，羧基化多壁碳納米管作為納米載體固載Ru(bpy)32+合成納米復(fù)合物（Ru(bpy)32+/MWCNTs）。通過測量ECL6