原位產(chǎn)生共反應(yīng)試劑及金屬納米材料構(gòu)建信號增強(qiáng)型電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的研究.pdf

1、電致化學(xué)發(fā)光(ECL)技術(shù)與生物傳感器相結(jié)合發(fā)展而來的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器，由于具有響應(yīng)快速、操作簡便、成本低、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。在生物傳感器的構(gòu)建中，如何實現(xiàn)信號放大并提高檢測靈敏度是關(guān)鍵。研究表明，向ECL發(fā)光體系中引進(jìn)酶促反應(yīng)，利用該反應(yīng)原位產(chǎn)生共反應(yīng)試劑可以大大地增強(qiáng)發(fā)光基團(tuán)的發(fā)光效率，進(jìn)而提高ECL生物傳感器的靈敏度。另外，納米材料具有大的比表面積、良好的生物兼容性、優(yōu)異的導(dǎo)電性以及高效的電催化

2、活性等特性，常被用于ECL生物傳感器的構(gòu)建中。尤其是金屬納米材料可以有效地增加生物分子和發(fā)光試劑的固載、促進(jìn)電子的傳遞、催化相應(yīng)底物放大ECL信號，進(jìn)一步提高傳感器的靈敏度?；诖?，本文結(jié)合酶促反應(yīng)原位產(chǎn)生共反應(yīng)試劑和金屬納米材料作為載體構(gòu)建了信號增強(qiáng)型ECL生物傳感器。
　　本論文主要從以下幾個方面開展研究工作:
　　1、基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和酶促原位產(chǎn)生魯米諾共反應(yīng)試劑的信號增強(qiáng)型電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器
　　基于雜交鏈

3、式反應(yīng)(HCR)用來固載酶作為信號放大策略，結(jié)合酶促反應(yīng)原位產(chǎn)生H2O2催化放大魯米諾的ECL信號，構(gòu)建了電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于羊抗鼠免疫球蛋白(IgG)的靈敏檢測。其中，L-半胱氨酸功能化的還原氧化石墨烯（L-cys-rGO）結(jié)合了L-半胱氨酸和還原氧化石墨烯的優(yōu)點，具有大的比表面積、良好的生物相容性、高效的電子傳輸能力和良好的導(dǎo)電性。在體系中，L-cys-rGO作為固載基質(zhì)滴涂到玻碳電極表面，然后抗體分子通過與L-cys-rGO

4、的羧基形成酰胺鍵，組裝至傳感界面。緊接著，采用夾心免疫模式，將生物素標(biāo)記的抗體(bio-anti-IgG)組裝至傳感界面上。利用生物素和親和素(SA)的特異性識別作用，以SA為橋梁，將生物素標(biāo)記的DNA鏈(S1)組裝至傳感界面上，S1再與葡萄糖氧化酶(GOD)標(biāo)記的DNA鏈(GOD-S2)和互補(bǔ)鏈(S3)發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。基于此，大量的GOD被成功地固載到了電極表面。當(dāng)向檢測底液中加入一定量的葡萄糖和魯米諾時，電極表面的GOD高效催化葡

5、萄糖原位生成過氧化氫(H2O2)。H2O2作為魯米諾的共反應(yīng)試劑，極大地增強(qiáng)了反應(yīng)體系的ECL信號。實驗結(jié)果表明:該傳感器對IgG的檢測具有很好的響應(yīng)，其線性范圍為0.10 pg·mL-1～100.0 ng·mL-1，檢測下限為33.0 fg·mL-1，且具有良好的靈敏度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和選擇性。另外，該方法還可應(yīng)用于其他癌胚抗原的分析檢測。
　　2、基于P似u雙金屬納米粒子和原位產(chǎn)生NADH作為共反應(yīng)試劑的高靈敏電致化學(xué)發(fā)光免疫

6、傳感器
　　利用Pt/Au雙金屬納米粒子(Pt/Au NPs)作為納米載體，結(jié)合酶促反應(yīng)原位生成共反應(yīng)試劑-NADH，構(gòu)建了電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于人心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)的靈敏檢測。首先，包覆大量發(fā)光物質(zhì)的納米金/摻雜鄰菲噦琳釕的二氧化鈦納米粒子(Au-RuSiO2 NPs)，被用作固載基質(zhì)。其次，具有大比表面積和良好電催化活性的Pt/Au NPs作為納米載體，固載大量的第二抗體(Ab2)、聚（L-組氨酸）(PLH)和葡萄

7、糖脫氫酶(GDH)。更重要的是，PLH保護(hù)的GDH具有優(yōu)良的催化活性，能高效地催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸內(nèi)酯，同時還原NAD+為NADH。NADH作為共反應(yīng)試劑與發(fā)光物質(zhì)鄰菲噦琳釕([Ru(phen)3]2+)發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而提高ECL信號和增強(qiáng)檢測靈敏度?；诖耍搨鞲衅饔糜赾TnⅠ分析檢測時表現(xiàn)出高靈敏性，線性響應(yīng)范圍為0.010 ng·mL-1～10.0 ng·mL-1，最低檢測限為3.33 pg·mL-1。另外，該傳感器具有較好的穩(wěn)

8、定性和選擇性，有望應(yīng)用于臨床分析診斷。
　　3、基于仿三酶協(xié)同催化原位產(chǎn)生共反應(yīng)試劑的信號增強(qiáng)型電致化學(xué)發(fā)光凝血酶適體傳感器
　　利用葡萄糖脫氫酶(GDH)和G-四鏈體-卟啉鐵（hemin/G-quadruplex）同時作為NADH氧化酶和辣根過氧化物模擬酶的仿三酶協(xié)同催化作用，原位產(chǎn)生氧氣(O2)增強(qiáng)過硫酸根的ECL信號，構(gòu)建了一個簡單、靈敏的電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器用于檢測凝血酶的濃度。該體系中，作為載體的金納米棒結(jié)合大量

9、GDH和hemin/G-quadruplex所形成的生物偶合物被用作第二適體(TBAⅡ)。通過在玻碳電極上電沉積一層金納米粒子用于固載巰基修飾的凝血酶適體鏈，再基于夾心法將制得的TBAⅡ組裝至電極表面。發(fā)光試劑過硫酸根存在于檢測底液中，當(dāng)加入適量的葡萄糖和NAD+時，GDH催化葡萄糖，同時還原NAD+為NADH;接著hemin/G-quadruplex首先作為NADH氧化酶，催化NADH氧化成NAD+，同時生成H2O2，再作為辣根過氧化