核酸雜交的基本原理

1、核酸雜交的基本原理核酸雜交的基本原理?原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下根據堿基互補的原則可以形成原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下根據堿基互補的原則可以形成雙鏈。雙鏈?；蚪M探針CDNA探針RNA探針的特點?基因組基因組DNA探針：為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。探針：為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。?制備：基因克隆；制備：基因克隆；PCR擴增基因組特定片段擴增基因組特定片段?優(yōu)點：

2、多克隆在載體中的優(yōu)點：多克隆在載體中的DNA片段，可以無限繁殖，量大；片段，可以無限繁殖，量大；PCR制備探針更加簡制備探針更加簡便省時。便省時。?cDNA探針：指互補于探針：指互補于mRNA的DNA分子。分子。?制備：以制備：以mRNA為模板，按照堿基互補的原則，經逆轉錄酶催化合成的。為模板，按照堿基互補的原則，經逆轉錄酶催化合成的。?優(yōu)點：不存在內含子和高度重復序列，是一種較為理想的核酸探針。優(yōu)點：不存在內含子和高度重復序列，是一種

3、較為理想的核酸探針。?RNA探針：以探針：以DNA兩條鏈中的任意一條為模板轉錄生成兩條鏈中的任意一條為模板轉錄生成RNA。?優(yōu)點：穩(wěn)定性高，雜交效率高，優(yōu)點：穩(wěn)定性高，雜交效率高，?缺點：易于降解和標記方法復雜。缺點：易于降解和標記方法復雜。探針標記的方法理想的探針標記物應具備以下特性：理想的探針標記物應具備以下特性：?敏感性高；敏感性高；?標記物與探針結合后，不影響雜交反應，尤其是雜交特異性、穩(wěn)定性和標記物與探針結合后，不影響雜交反應

4、，尤其是雜交特異性、穩(wěn)定性和Tm值；值；?檢測方法要高靈敏性、高特異性、穩(wěn)定、簡便、假陽性率低；檢測方法要高靈敏性、高特異性、穩(wěn)定、簡便、假陽性率低；?標記對環(huán)境污染小，對人體無損傷，價格低；標記對環(huán)境污染小，對人體無損傷，價格低；?標記物對檢測方法無干擾。標記物對檢測方法無干擾。放射性同位素標記放射性同位素標記?放射性同位素標記法放射性同位素標記法缺口平移法缺口平移法隨機引物法隨機引物法DNA探針的末端標記探針的末端標記5’端標記法3

5、’端標記法PCR標記標記DNA探針探針非放射性標記非放射性標記酶促反應標記法酶促反應標記法化學修飾標記法化學修飾標記法各種固相雜交方法的適用范圍各種固相雜交方法的適用范圍雜交類型雜交類型檢測目的及范圍檢測目的及范圍Southern印跡雜交印跡雜交檢測經凝膠電泳分離且轉移至膜上的檢測經凝膠電泳分離且轉移至膜上的DNA分子分子Nthern印跡雜交印跡雜交檢測經凝膠電泳分離且轉移至膜上的檢測經凝膠電泳分離且轉移至膜上的RNA分子分子菌落雜交菌

6、落雜交檢測固定在膜上、經裂解從細菌體釋放的檢測固定在膜上、經裂解從細菌體釋放的DNA分子分子?RNA極易降解，提取過程中需注意極易降解，提取過程中需注意RNA酶污染；酶污染；?雜交前實驗過程中所用器材最好與雜交前實驗過程中所用器材最好與Souther印跡實驗的分開使用，防止印跡實驗的分開使用，防止RNA酶的酶的污染；污染；?RNA變性的方法與變性的方法與DNA不同；不同；?印跡前將含甲醛印跡前將含甲醛(變性劑變性劑)的凝膠用水沖洗掉，然

7、后再印跡、雜交；的凝膠用水沖洗掉，然后再印跡、雜交；?如果測定如果測定RNA片段大小，可在同一塊膠上加上分子量標記物一同電泳，之后將標片段大小，可在同一塊膠上加上分子量標記物一同電泳，之后將標記物切下、上色、照像，樣品膠則進行記物切下、上色、照像，樣品膠則進行Nthern轉印。轉印。5.原位雜交原位雜交?定義：是以特定標記的已知序列的核酸分子作為探針，與細胞或組織切片中核酸進定義：是以特定標記的已知序列的核酸分子作為探針，與細胞或組織切

8、片中核酸進行雜交并對其檢測的方法。行雜交并對其檢測的方法。基本方法：基本方法：A.細胞或組織切片的處理細胞或組織切片的處理B.增強組織的通透性和核酸探針的穿透性增強組織的通透性和核酸探針的穿透性C.預雜交預雜交D.雜交雜交E.雜交后處理雜交后處理F.結果檢測結果檢測生物芯片技術生物芯片技術?生物芯片：指包被在固相載體上的高密度生物芯片：指包被在固相載體上的高密度DNA、抗原、抗體、細胞或組織的微點、抗原、抗體、細胞或組織的微點陣(mic

9、roarray)。?主要特點：高通量、微型化和自動化主要特點：高通量、微型化和自動化?未來十年最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g。未來十年最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g。常用的生物芯片的分類：常用的生物芯片的分類：?基因芯片基因芯片?蛋白質芯片蛋白質芯片?縮微芯片實驗室縮微芯片實驗室基因芯片基因芯片?又稱又稱DNA芯片或芯片或DNA微陣列。微陣列。?將大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體上，稱為基因芯將大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片

10、或纖維膜等載體上，稱為基因芯片。片?；蛐酒脑砼c制備基因芯片的原理與制備?根據核酸雜交的原理，將大量探針分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜根據核酸雜交的原理，將大量探針分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布來進行分析。交，通過檢測雜交信號的強度及分布來進行分析。DNA芯片技術包括四個主要步驟：芯片技術包括四個主要步驟：?芯片的設計與制備芯片的設計與制備?樣品制備樣品制備?雜交反應和信號檢測