核酸探針的設(shè)計(jì)及其在疾病檢測(cè)和酶學(xué)研究中的應(yīng)用.pdf

1、本文結(jié)合分子信標(biāo)核酸探針和染料探針技術(shù)，建立了丙肝病毒核酶切割產(chǎn)物和限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)物的超靈敏檢測(cè)方法和簡(jiǎn)便快捷的地中海貧血遺傳病點(diǎn)突變基因分型的方法；建立了體外監(jiān)測(cè)DNA復(fù)制過程聚合反應(yīng)的熒光方法；探討了生命活動(dòng)過程中有重要意義的連接酶的連接機(jī)理和聚合酶的活性實(shí)時(shí)分析。更重要的是，開發(fā)并研制了三種新型的核酸探針—核酶分子探針、熔點(diǎn)擴(kuò)大核酸探針和信號(hào)擴(kuò)增核酸探針，用于丙肝病毒核酶切割過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和地中海貧血遺傳病點(diǎn)突變的檢測(cè)。主要內(nèi)

2、容歸納如下： 1、建立了核酶切割產(chǎn)物的超靈敏檢測(cè)方法。核酶是具有切割特定RNA序列能力的小RNA分子，在抗病毒、抗惡性腫瘤基因治療中有著重要意義。目前核酶切割產(chǎn)物的研究方法，一般需要將核酶或底物RNA進(jìn)行標(biāo)記，不利于核酶臨床研究與應(yīng)用。本論文利用分子信標(biāo)作為核酶切割產(chǎn)物的連接模板和檢測(cè)分子，在RNA/DNA核酸雜合體連接過程中，核酶切割產(chǎn)物的信息被實(shí)時(shí)轉(zhuǎn)換為熒光信號(hào)。實(shí)現(xiàn)了在不標(biāo)記核酶或RNA底物的情況下，高靈敏高特異地檢測(cè)丙肝

3、病毒核酶切割產(chǎn)物，檢測(cè)下限可達(dá)0.05 nmol/L。為真實(shí)準(zhǔn)確反映核酶切割反應(yīng)提供了一種簡(jiǎn)便快捷的非同位素分析方法，也為核酶基因藥物的快速篩選、核酶動(dòng)力學(xué)、核酶在基因治療中的深入研究提供了新的思路和技術(shù)。 2、建立了限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)物的超靈敏檢測(cè)方法。利用分子信標(biāo)作為限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)物的連接模板和檢測(cè)探針，在DNA/DNA核酸雜合體連接過程中，將切割產(chǎn)物的信息實(shí)時(shí)轉(zhuǎn)換為熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了在不標(biāo)記限制性內(nèi)切酶底物的情況下，高靈

4、敏高特異地檢測(cè)限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)物。其線性響應(yīng)范圍為0.2 nmol/L到30nmol/L，檢測(cè)下限可達(dá)0.05 nmol/L。該方法不僅可用于限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)物的檢測(cè)，還可用于其它水解酶切割產(chǎn)物的檢測(cè)。 3、建立了DNA連接酶連接機(jī)理研究的新方法。核酸連接是生命科學(xué)中倍受關(guān)注的生命活動(dòng)。其機(jī)理研究有助于進(jìn)一步拓展核酸連接反應(yīng)在疾病檢測(cè)、基因載體及核酸修飾與分析等方面的應(yīng)用。利用分子信標(biāo)作為核酸連接的模板和信號(hào)產(chǎn)生分予，研究了T4 D

5、NA連接酶的連接機(jī)理。為連接酶連接機(jī)理及其連接動(dòng)力學(xué)過程研究提供了一種簡(jiǎn)便快捷的方法。該方法不僅可用于T4 DNA連接酶機(jī)理研究，還可用于其它DNA連接酶及RNA連接酶的研究。 4、建立了體外監(jiān)測(cè)DNA復(fù)制過程中聚合反應(yīng)的熒光方法。DNA復(fù)制是最基本的生命活動(dòng)之一，其研究對(duì)于探討生命繁衍、生存與進(jìn)化問題有重要意義。目前DNA復(fù)制的研究，一般采用放射性標(biāo)記與凝膠電泳相結(jié)合的方法，操作復(fù)雜，不利于方便快捷地捕獲生命活動(dòng)過程中的重要信

6、息。利用分子信標(biāo)監(jiān)測(cè)DNA的體外連續(xù)復(fù)制和不連續(xù)復(fù)制過程，以熒光信號(hào)的方式直接方便地表征出復(fù)制過程中聚合反應(yīng)的有關(guān)重要信息，避免了傳統(tǒng)的DNA復(fù)制分析方法中的放射性同位素標(biāo)記、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳等復(fù)雜操作。并利用該體系，建立了三種聚合酶的定量分析方法。 5、建立了簡(jiǎn)便快速的聚合酶活性實(shí)時(shí)分析新方法。聚合酶作為生命活動(dòng)過程中的一種重要的酶，目前已廣泛應(yīng)用于基因測(cè)序，載體制備及基因克隆等方面。利用染料探針技術(shù)，建立了一種簡(jiǎn)便快捷

7、地實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)聚合酶活性的方法，探討了三種抗腫瘤藥物對(duì)聚合酶活性的影響，為以聚合酶為作用靶標(biāo)的抗腫瘤新藥的開發(fā)及篩選提供了一種新的思路。 6、建立了地中海貧血遺傳病點(diǎn)突變檢測(cè)的簡(jiǎn)便方法。地中海貧血是一種常見的點(diǎn)突變性遺傳病，發(fā)展一種操作簡(jiǎn)便、成本低廉的檢測(cè)方法對(duì)該遺傳病的普查及產(chǎn)前診斷有重要意義?；谌玖咸结樇夹g(shù)，結(jié)合聚合酶特異性延伸反應(yīng)，發(fā)展了一種簡(jiǎn)單、快速、成本低的單核苷酸多態(tài)性基因分型方法，并用于地中海貧血遺傳病點(diǎn)突變的基因分

8、型。 7、核酶分子探針的設(shè)計(jì)及其對(duì)丙肝病毒核酶切割過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。核酶切割反應(yīng)的研究，一直使用傳統(tǒng)的放射性同位素標(biāo)記與變性聚丙烯酰胺凝膠電泳相結(jié)合的方法，操作繁瑣復(fù)雜，并且不能實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地提供核酶切割過程的信息。通過將核酶底物修飾，在其兩端分別加上6個(gè)堿基形成互補(bǔ)臂，構(gòu)建了一種新的核酶分子探標(biāo)，它將核酶切割反應(yīng)的信息實(shí)時(shí)同步轉(zhuǎn)換為熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了丙肝病毒核酶切割過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。與已有研究方法比較，該方法是一種非同位素標(biāo)記、高靈敏

9、高特異的核酶切割反應(yīng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)方法。為核酶活性分析、核酶動(dòng)力學(xué)研究提供新型有效的手段，也為核酶基因藥物的深入研究提供了新的方法和思路。 8、熔點(diǎn)擴(kuò)大核酸探針的設(shè)計(jì)及其在點(diǎn)突變檢測(cè)中的應(yīng)用。許多遺傳性疾病的發(fā)生發(fā)展與點(diǎn)突變密切相關(guān)，點(diǎn)突變的準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)這些疾病的預(yù)防、臨床檢測(cè)和分子診斷有重大意義。目前基于熔點(diǎn)分析的方法對(duì)于基因型之間有顯著差異的點(diǎn)突變，能快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，但是對(duì)于一些基因型之間熔點(diǎn)差異較小的點(diǎn)突變，不能進(jìn)行有效判斷。基于

10、熒光共振能量轉(zhuǎn)移和連接酶技術(shù)，設(shè)計(jì)了一種新的核酸探針，用于顯著提高點(diǎn)突變不同基因型之間的熔點(diǎn)差異，實(shí)現(xiàn)了點(diǎn)突變準(zhǔn)確快速的基因分型研究。利用該方法，成功實(shí)現(xiàn)了地中海貧血遺傳病兩種普遍存在的點(diǎn)突變CD17(A→T)和Ivs-2-654(C→T)的基因分型。該方法能對(duì)各種點(diǎn)突變類型進(jìn)行檢測(cè)，具有良好的保真性，而且操作簡(jiǎn)便，不需要離心、電泳、分離等復(fù)雜繁瑣的步驟，有望在臨床檢測(cè)和應(yīng)用上發(fā)揮重要作用。 9、信號(hào)擴(kuò)增核酸探針的設(shè)計(jì)及其在點(diǎn)突

11、變檢測(cè)中的應(yīng)用。高靈敏的點(diǎn)突變檢測(cè)方法，目前一般是基于單分子檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行，昂貴的檢測(cè)裝置使其在臨床應(yīng)用受到一定限制?；谖⑶蚋患夹g(shù)與連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增技術(shù)，發(fā)展了一種新的核酸探針來高靈敏、方便快捷的進(jìn)行點(diǎn)突變檢測(cè)。樣品的基因型通過檢測(cè)微球上捕獲的熒光連接產(chǎn)物方便快速的獲得。該方法具有很高的靈敏度，能檢測(cè)到600個(gè)拷貝的靶序列。這種方法，不僅能對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)，而且能直接以抽提的總DNA進(jìn)行點(diǎn)突變檢測(cè)，再加上其操作簡(jiǎn)便、