雙光子細(xì)胞膜和核糖核酸探針的合成及其在活細(xì)胞熒光成像中的應(yīng)用.pdf

1、最近研究表明，在活體成像中，雙光子熒光顯微成像技術(shù)比共聚焦成像具有更多的優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)具有低的光毒性和光漂白性、高的檢測(cè)靈敏度和無(wú)成像扭曲等優(yōu)勢(shì)。另外，由于雙光子顯微鏡其本身就有高的軸向分辨率，它不需要像共聚焦顯微鏡那樣通過(guò)針孔來(lái)提高成像效果。更重要的是，由于它的長(zhǎng)波段激發(fā)有效避免了細(xì)胞的光損傷，避開了紫外和藍(lán)光的照射并且使散焦照射減少。從而使得雙光子顯微鏡可以在不損害細(xì)胞活性的條件下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)成像。為了適應(yīng)當(dāng)前形勢(shì)，各種能夠成

2、像活細(xì)胞內(nèi)不同靶標(biāo)的熒光探針已經(jīng)被廣泛的運(yùn)用到雙光子熒光顯微成像研究中。但是，目前在細(xì)胞和組織的三維成像檢測(cè)中，依然缺乏優(yōu)良的雙光子熒光探針，這一現(xiàn)狀亟待解決。本論文主要對(duì)不同雙光子熒光探針的成像特點(diǎn)進(jìn)行了研究。
　　首先，本論文介紹了細(xì)胞膜探針。生物膜是通過(guò)脂質(zhì)、蛋白和糖類等自組裝而成的雙層膜結(jié)構(gòu)。在這個(gè)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)中，脂質(zhì)是膜骨架中的主要組成成分，對(duì)膜的功能和性質(zhì)產(chǎn)生巨大影響。通過(guò)最近生物膜理論分析，生物膜的構(gòu)成中由富含膽固醇和

3、鞘磷脂的膜有序相和含非飽和鏈脂質(zhì)體和膽固醇的膜無(wú)序相組成。在細(xì)胞膜的相態(tài)研究中，有序相的假設(shè)主要是來(lái)自富含膽固醇和鞘磷脂的不溶性細(xì)胞膜碎片的發(fā)現(xiàn)，這種假設(shè)一直激發(fā)著相關(guān)學(xué)者深入的研究和討論，這是由于它們的證據(jù)主要通過(guò)間接的技術(shù)來(lái)提供，所以一直未能實(shí)現(xiàn)有序相的可視性。一些研究者認(rèn)為，有序相參與了相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞粘附、信號(hào)傳遞和脂質(zhì)體或蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。一直以來(lái)，研究者是通過(guò)人工膜模仿有序相來(lái)代替對(duì)細(xì)胞膜相關(guān)區(qū)域進(jìn)行研究。近年來(lái)，生物膜有序相

4、是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，但是在細(xì)胞膜相關(guān)區(qū)域的研究仍然具有挑戰(zhàn)。綜上所述，為了更好的理解有序相在生物膜內(nèi)的作用，必須實(shí)現(xiàn)生物膜該區(qū)域的可視性。但是，由于生物膜結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，對(duì)細(xì)胞及組織意義上的有序相研究一直存在困難，為了成像活細(xì)胞膜的有序相，在第二章中，本論文設(shè)計(jì)合成了一種新型的熒光探針HVC-12，該探針基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光的機(jī)理選擇性成像了細(xì)胞膜和組織中的有序相。由于探針HVC-12聚集誘導(dǎo)發(fā)光的特性，它的納米聚集顆粒點(diǎn)亮了細(xì)胞膜的剛性區(qū)域。

5、本論文首次發(fā)現(xiàn)，在活細(xì)胞膜上有序相呈現(xiàn)的是非連續(xù)的分布（1-1.5μm的間隔）。更重要的是，這種探針與商業(yè)化的膜探針（如DiD）相比，探針HVC-12對(duì)細(xì)胞膜表現(xiàn)出了高的靈敏性;大的斯托克斯位移和雙光子活性吸收截面;好的光穩(wěn)定性;并能成像和追蹤細(xì)胞膜的動(dòng)態(tài)變化。這些優(yōu)異的光物理性質(zhì)，使這種新型的探針HVC-12成為研究生物膜強(qiáng)有力的工具。
　　其次，核酸是細(xì)胞中重要的生物大分子，其定量分析、特異性識(shí)別、對(duì)基因組學(xué)、病毒學(xué)、分子生物

6、學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展具有十分重要的意義。本論文針對(duì)核酸開展包括DNA及RNA在內(nèi)的雙光子核酸探針的制備及細(xì)胞成像方面的研究工作?；谇捌诠ぷ?，本論文通過(guò)雙光子核酸探針的設(shè)計(jì)、合成及表征，探索陽(yáng)離子有機(jī)小分子專一性識(shí)別內(nèi)源性RNA的內(nèi)在規(guī)律、分子構(gòu)型對(duì)專一性識(shí)別能力的影響，掌握核酸探針的調(diào)控機(jī)制，最終達(dá)到了制備核酸探針的目的。我們知道，多種多樣的分子探針一直為檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)的RNA而研發(fā)，包括寡核苷酸探針、非線性熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針、雙標(biāo)記的

7、寡核苷酸發(fā)夾探針（分子信標(biāo)）、雙熒光共振能量轉(zhuǎn)移分子信標(biāo)、自動(dòng)結(jié)扎探針和利用蛋白作報(bào)道基團(tuán)的探針。但是，這些RNA探針不具有好的膜通透性，它常常通過(guò)微注射技術(shù)進(jìn)入活細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。但是這種技術(shù)往往造成細(xì)胞損傷從而造成細(xì)胞的生物功能的紊亂，因此，開發(fā)一種低分子量的膜通透性雙光子RNA熒光探針是非常重要的。
　　在本論文的第三章中，基于吲哚的單離子鹽（INR1/INR2）被成功合成和表征，通過(guò)體外的波譜分析和在不同細(xì)胞系內(nèi)的單雙光子成像

8、研究發(fā)現(xiàn)，INR1和INR2作為兩種選擇性熒光開關(guān)探針，與RNA綁定后，探針都具有大的雙光子活性吸收截面。在活細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)中，兩種探針具有好的膜通透性，并能用雙光子和共聚焦顯微鏡能在活細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和核仁中成像RNA。此外，它們?cè)谂c一種重要的DNA-RNA共區(qū)域化的DNA染料Hoechst33342復(fù)染活細(xì)胞時(shí)，表現(xiàn)出好的復(fù)染兼容性。
　　在本論文的第四章中，一種新的咔唑雙離子鹽HVC-6被設(shè)計(jì)和合成。更重要的是，在活細(xì)胞和固定細(xì)胞

9、中，它能夠雙光子成像細(xì)胞內(nèi)分布在細(xì)胞質(zhì)和核仁區(qū)域的RNA.。而且，它們?cè)谂c另一種重要的DNA-RNA共區(qū)域化的DNA染料DAPI復(fù)染活細(xì)胞時(shí)，表現(xiàn)出好的復(fù)染兼容性。
　　在本論文的第五章中還是集中于能夠成像細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)的小分子量探針的研究。在本章中，基于吲哚單離子鹽，本章設(shè)計(jì)了低分子量的線粒體探針I(yè)NSC12。由于這種鹽的熒光團(tuán)具有長(zhǎng)的烷基鏈，分子與脂質(zhì)膜可以產(chǎn)生強(qiáng)的相互作用，探針I(yè)NSC12表現(xiàn)出好的膜通透性，并在短時(shí)間內(nèi)能夠點(diǎn)

10、亮細(xì)胞膜并進(jìn)一步點(diǎn)亮細(xì)胞內(nèi)的線粒體。更重要的是，這種探針擁有快速檢測(cè)線粒體的能力，并能在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)觀測(cè)到線粒體的動(dòng)態(tài)變化，一定程度上承受了微環(huán)境變化的耐性。
　　綜上所述，本論文中一些高靈敏性的細(xì)胞膜、RNA和線粒體探針(HVC-12/HVC-18，INR1/INR2/HVC-6和INSC12)被成功設(shè)計(jì)和合成。尤其是本章基于全新的AIE機(jī)理在活細(xì)胞和深層組織中首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞膜有序相的檢測(cè)。另外，利用共聚焦和雙光熒光顯微鏡，探針I(yè)