切口酶介導(dǎo)增益性RCA信號放大microRNA檢測adddd dfdd新方法研究.pdf

1、生命個(gè)體由多種有機(jī)物及無機(jī)物組成，生物體的種種生命活動(dòng)是化合物相互間高度有序作用的結(jié)果。人們對生命現(xiàn)象的研究不再只停留在個(gè)體、系統(tǒng)、器官、組織及細(xì)胞水平上，更要探討組成生物體的物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。因此，對生物大分子的檢測，是生命科學(xué)研究及醫(yī)學(xué)診斷的實(shí)際需要。傳統(tǒng)的檢測技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)、western印跡、質(zhì)譜，存在儀器昂貴、耗時(shí)、操作復(fù)雜的問題。隨著檢測技術(shù)在醫(yī)療領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，對快速、簡便的檢測方法的需求不斷擴(kuò)大。等溫檢測對儀器要求

2、低，操作簡便，可以在有限的條件下進(jìn)行檢測。
　　非編碼小RNA在體內(nèi)起多重調(diào)控作用，是生物體內(nèi)一類重要的物質(zhì)。有數(shù)種類型的小型非編碼RNA在真核細(xì)胞中發(fā)揮功能，其中包括18-24個(gè)核苷酸的microRNA，21個(gè)核苷酸的siRNAs，26-30個(gè)核苷酸的piRNA。microRNA是基因表達(dá)的內(nèi)生調(diào)控元件，主要功能是在轉(zhuǎn)錄后抑制mRNA翻譯。高靈敏度、高特異性的小RNA檢測不僅是研究受這些RNA調(diào)控的生理過程的需要也是更好地理解相

3、關(guān)疾病的需要。
　　惡性腫瘤已經(jīng)成為人類死亡的第一位原因，每年約有上千萬人死于各種癌癥。癌癥由多因素引起的疾病。隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展和生活方式的變化，腫瘤的發(fā)病率與死亡率呈明顯上升趨勢。早期的腫瘤較容易切除，可以延長患者存活時(shí)間。因此，腫瘤的早期診斷和預(yù)防是現(xiàn)今腫瘤臨床研究的熱點(diǎn)。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)，microRNA與多種人類腫瘤相關(guān)。并有實(shí)驗(yàn)證實(shí)microRNA既有抑癌作用,又有促癌作用。microRNA是基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

4、的重要組成部分，影響著多條信號傳導(dǎo)通路。對不同腫瘤組織特定microRNA表達(dá)水平的檢測和研究不但利于闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，而且可以為腫瘤的診斷和治療提供理論依據(jù)。
　　以核酸互補(bǔ)雜交原理為基礎(chǔ)，人們根據(jù)microRNA的特點(diǎn)發(fā)展了許多的檢測方法。其中，等溫技術(shù)在現(xiàn)場快速檢測診斷方面優(yōu)勢明顯。而且核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)由于不需要溫度變化的時(shí)間過程，使其擺脫了對變溫儀器的依賴，實(shí)現(xiàn)快速檢測。
　　由于以上原因，綜合文獻(xiàn)報(bào)道，本研究

5、選擇microRNA let-7a作為檢測對象，聯(lián)用了分子信標(biāo)、鎖式探針、連接酶、聚合酶 phi29、限制性單鏈切割酶Nt.BbvCI，建立了一種簡便、快速的生物大分子熒光信號放大檢測技術(shù)，即切口酶介導(dǎo)增益性RCA信號放大microRNA檢測。我們設(shè)計(jì)了一種帶兩個(gè)切口酶Nt.BbvCI的鎖式探針與分子信標(biāo)，當(dāng)鎖式探針與let-7a結(jié)合后，在連接酶的作用下形成環(huán)，然后聚合酶以microRNA為引物，以環(huán)為模板進(jìn)行滾環(huán)反應(yīng)。鎖式探針及分子信