基于金磁微粒的核酸純化新方法.pdf

1、核酸(DNA或RNA)純化是分子生物學(xué)下游實(shí)驗(yàn)和核酸水平臨床檢測(cè)的重要前提，純化總體原則是高純度核酸樣品的獲得和保證核酸結(jié)構(gòu)的完整性。現(xiàn)有核酸純化方法包括酚一氯仿抽提，高鹽沉淀，離子交換和選擇性吸附等。但方法存在不環(huán)保(使用有毒試劑)，操作繁瑣(多次離心)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量(難以大規(guī)模自動(dòng)化操作)等缺點(diǎn)。納微米超順磁性復(fù)合微粒，在核酸純化方面體現(xiàn)出較大優(yōu)勢(shì)，與現(xiàn)有核酸純化技術(shù)相比，無(wú)需離心，操作簡(jiǎn)便快速，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量，自動(dòng)化。國(guó)外已有以

2、磁性復(fù)合微粒為載體純化核酸的相關(guān)試劑盒產(chǎn)品，國(guó)內(nèi)在此方面的研究與開發(fā)還較為落后。 本研究以我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型磁性復(fù)合微粒一金磁微粒為載體，建立了從大鼠肝臟純化總核酸(即基因組DNA和總RNA)的方法。選擇硫氰酸胍(Guanidin。Thiocyanate，GTC)裂解體系，將裂解后的樣本與金磁微?；旌?，總核酸將結(jié)合在金磁微粒表面，經(jīng)過(guò)清洗后將吸附在金磁微粒表面的總核酸即可洗脫下來(lái)。純化得到的總核酸在260 11111處有特

3、征紫外吸收峰，凝膠電泳分析可見基因組DNA和28S RNA及18S RNA條帶，其28S與18S RNA條帶的比例約為2：1。建立的方法也適用于大鼠心、脾、肺、腎等組織的總核酸純化。將該方法初步用于其它生物樣本如細(xì)胞、細(xì)菌、植物、全血總核酸的純化，同樣獲得較為理想的結(jié)果。 對(duì)建立的金磁微粒純化總核酸的方法進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：金磁微粒純化核酸回收率為80％，方法的批內(nèi)差從5.06％到16.29％，批間差從4.22％到20.5

4、％，可穩(wěn)定用于肝臟組織總核酸純化。純化得到總核酸作為模板用于B.action基因的RT-PCR反應(yīng)，能夠擴(kuò)增出目的片段，說(shuō)明總核酸樣品純度高，不含抑制RT-PCR.反應(yīng)的抑制劑。 不經(jīng)總核酸洗脫步驟，用DNase消化金磁微粒.總核酸復(fù)合物，可以得到總RNA。該方法能夠從10 mg大鼠肝臟中純化得到約40 lxg總RNA，OD260/OD280在2.0左右。純化得到總RN.A能夠應(yīng)用于RT：PCR反應(yīng)。同樣，用RNase消化金磁

5、微粒一總核酸復(fù)合物可以得到基因組DNA，從10 mg大鼠肝臟中純化得到約5 pg的DNA，OD260/OD280為1.78。此外，制備共價(jià)偶聯(lián)oligo(dT)20功能化磁性微粒，并以此為載體，從總核酸中純化mRNA，凝膠電泳結(jié)果可見清晰彌散的mRNA，沒有rRNA的污染，以純化得到的。mRNA作RT-PCR反應(yīng)，能夠擴(kuò)增出目的條帶。綜上所述，本研究建立了以金磁微粒從動(dòng)物組織中純化總核酸(包括基因組DNA和總RNA)的方法。在不洗脫總核