以金磁微粒為載體的全血基因組DNA純化方法研究.pdf

1、磁性復(fù)合微粒是由高分子或無機(jī)材料與磁性超細(xì)粉末(如鐵的氧化物、鐵、鈷、鎳等金屬)構(gòu)成的具有超順磁性的膠態(tài)復(fù)合材料。近年來，結(jié)合磁性氧化物粒子和膠體金特點(diǎn)，F(xiàn)e3O4/Au組成的無機(jī)·無機(jī)磁性復(fù)合微粒(簡(jiǎn)稱金磁微粒)成為研究熱點(diǎn)。由于具有粒徑小，比表面積大，超順磁性及可修飾生物分子等特性，借助外加磁場(chǎng)的使用，這種新型磁性復(fù)合微粒已被用于免疫學(xué)檢測(cè)、酶的固定化、蛋白分離等領(lǐng)域。以課題組自主研制的金磁微粒為載體，本文建立了全血基因組DNA純化

2、方法，并對(duì)相關(guān)問題進(jìn)行系統(tǒng)探討。 以人全血、豬血、大鼠血液等為樣本，通過對(duì)純化過程中裂解條件、結(jié)合體系、金磁微粒用量及非特異性吸附雜質(zhì)的清洗、DNA洗脫等環(huán)節(jié)的優(yōu)化，，建立了從哺乳動(dòng)物全血中純化基因組DNA的方法。通過紫外吸收檢測(cè)、電泳分析、PCR擴(kuò)增等手段對(duì)方法的可靠性(包括得率、純度、批內(nèi)差、批間差等)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，證實(shí)純化得到的DNA可滿足PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的要求。此外，以雞血為樣本，對(duì)純化體系進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，建立了禽類動(dòng)物全

3、血基因組DNA純化方法。結(jié)果表明：從100μL人全血中可純化得到基因組DNA為2～5μg，從5μL雞全血中可得到基因組DNA約20μg，其A260/280值均在1.70～1.90之間，純化所得DNA分子結(jié)構(gòu)完整；同一批次金磁微粒純化得到DNA得率批內(nèi)差小于7％，三個(gè)不同批次金磁微粒純化得到DNA得率的批間差小于20％。整個(gè)純化過程可在50 min內(nèi)完成，操作簡(jiǎn)單、不涉及酚，氯仿等有毒試劑，可與國(guó)外同類純化方法相媲美。 在金磁微

4、粒為載體的DNA純化體系建立過程中，發(fā)現(xiàn)存在一定的背景值，即以超純水替代血樣完成的操作過程，其洗脫液在260 nm處亦有較小特征吸收，對(duì)比發(fā)現(xiàn)國(guó)外同類產(chǎn)品也存在不同程度的背景值。據(jù)此，對(duì)產(chǎn)生背景的主要原因作了分析，結(jié)果表明，金磁微粒組成中的表面鐵的組分和洗脫液中的EDTA形成金屬螯合物的反應(yīng)可能是導(dǎo)致背景值的主要原因，升高溫度可以加速該反應(yīng)。對(duì)比Fe3O4磁粒和金磁微粒，結(jié)果表明單純Fe3O4磁粒的空白背景(在260 nm處吸收峰)是金