玉米中伏馬菌素B1和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫學(xué)快速篩選方法研究.pdf

1、伏馬菌素(Fumonisins,FBs)是主要由串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)產(chǎn)生的有毒水溶性代謝產(chǎn)物,大多存在于玉米及玉米制品中。其中FB1是伏馬菌素的主要組分,也是導(dǎo)致伏馬菌素毒性作用的主要原因。FB1具有神經(jīng)毒性、免疫系統(tǒng)毒性和致癌性等。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是主要由禾谷鐮刀菌(Egraminearum)和黃色鐮刀菌(Eculmorum)產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性相似的有毒

2、代謝產(chǎn)物,是一種單端孢霉烯族化合物,常污染玉米、小麥和大麥等谷物及其制品,具有免疫毒性、胚胎毒性和細胞毒性等。目前用于檢測FB1和DON的方法主要有生物學(xué)鑒定法、理化檢測法和免疫分析法等。其中免疫分析法具有靈敏度高、特異性好、樣品前處理簡單等優(yōu)點,適合于大批量樣品的現(xiàn)場快速檢測。本實驗在自制FB1-OVA、DON-BSA全抗原及抗FB1、DON單克隆抗體的基礎(chǔ)上,分別建立了檢測玉米中FB1和DON的直接競爭ELISA(Dc-ELISA)

3、和同時檢測玉米中FB1和DON的膜基質(zhì)免疫分析法。
　　 本研究采用EDC法和CDI法分別制備FB1-OVA、DON-BSA全抗原,采用戊二醛一步法、戊二醛二步法、過碘酸鈉法、三聚氰氯法、三聚氰氯快速法分別制備了不同質(zhì)量投料比的抗FB1酶標抗體和抗DON酶標抗體。經(jīng)效價和直接競爭ELISA測試后,比較得知以三聚氰氯快速法合成的抗FB1酶標抗體效價最高,可達1024000,IC50值最低,為3.0 ng/mL,該合成方法最簡單,此

4、時合成該酶標抗體需要的抗FB1單克隆抗體與HRP的質(zhì)量投料比為1:2,抗FB1酶標抗體克分子比為2.92,酶結(jié)合率為51％,標記率為0.84454;以戊二醛二步法合成的抗DON酶標抗體IC50值最低,為75.3 ng/mL,該方法重復(fù)性最好,此時合成該酶標抗體需要的抗DON單克隆抗體與HRP的質(zhì)量投料比為1:20,抗DON酶標抗體克分子比為2.69,酶結(jié)合率為3.345%,標記率為0.6935。
　　 利用抗FB1酶標抗體建立了

5、檢測玉米中FB1的直接競爭ELISA,經(jīng)棋盤滴定確定,該方法的最佳FB1-OVA全抗原的包被濃度為1μg/mL,FB1酶標抗體(CC-1-FB1 McAb-HRP)的工作濃度為1:32000,IC50=2.97 ng/ml,檢測范圍為0.56～15.6 ng/mL,批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于10%,回收率在83.8～93.2%,與FB2的交叉反應(yīng)率為16%,與其他常見真菌毒素(DON,AFB1,OTA,ZEN,T-2,HT-2)未見交叉反

6、應(yīng)。
　　 利用抗DON酶標抗體建立了檢測玉米中DON的直接競爭ELISA,經(jīng)棋盤滴定確定,該方法的最佳DON-BSA全抗原的包被濃度為1μg/mL,DON酶標抗體(GA-2-DON McAb-HRP)的工作濃度為1:16000。IC50=77.267 ng/mL,檢測范圍為16.61～359.36 ng/mL,批內(nèi)變異系數(shù)小于10%,批間變異系數(shù)為16.66%,回收率在90.28～97.7%,與常見真菌毒素(AFB1,OTA,

7、ZEN,T-2,HT-2,FB1,FB2)未見交叉反應(yīng)。
　　 以直接競爭ELISA為反應(yīng)原理,聚偏氟乙烯膜為載體,建立了一種簡便、快速、高特異性、可同時檢測玉米中FB1和DON的膜免疫直接競爭分析法。樣品前處理簡單,整個過程只需一步加樣,15 min內(nèi)能目測判定結(jié)果,該方法獲得的FB1、DON的檢測限分別為2.5 ng/mL、50 ng/mL,使用有效期不少于180天,具有穩(wěn)定性好、結(jié)果準確易于判定、經(jīng)濟實用等優(yōu)點,非常適合于