伏馬菌素B1免疫學快速檢測方法的研究.pdf

1、目前真菌毒素已經成為食品中重要的污染源之一，其中伏馬菌素（Fumonisins，F(xiàn)）是污染較為嚴重的真菌毒素之一，它是一組主要由串珠鐮刀菌、多育鐮刀菌等鐮刀菌在一定條件下繁殖所產生的代謝毒物，其主要成分為伏馬菌素B1（FB1），并且大多存在于糧食和飼料中。伏馬菌素不僅具有肝腎毒性和肺毒性，而且具有神經毒性、免疫系統(tǒng)毒性和致癌性等強烈毒性，因此糧食及其制品中伏馬菌素的污染會對畜牧業(yè)的健康發(fā)展以及人類的身體健康造成嚴重的威脅。目前常用于檢測

2、伏馬菌素B1的方法有薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯(lián)用法等，但這些方法都具有很多缺點，如需要對樣品進行復雜的前處理過程、需要價格高昂儀器設備、需要消耗大量時間、需要大量的人力物力等等，因此建立針對伏馬菌素的免疫學快速檢測方法就顯得尤為重要。本研究在制備伏馬菌素B1人工抗原的基礎之上，通過單克隆抗體技術篩選出了抗伏馬菌素B1的單克隆抗體，建立了伏馬菌素B1的間接競爭ELISA檢測方法，制備了檢測伏馬菌素B1的間接競

3、爭ELISA快速檢測試劑盒。
　　本研究主要內容包括：⑴采用碳二亞胺（EDC）法將FB1與載體蛋白偶聯(lián)合成了人工抗原，經過SDS-PAGE凝膠電泳鑒定，偶聯(lián)蛋白的遷移速率遠遠小于載體蛋白，說明偶聯(lián)成功，然后用免疫抗原免疫小鼠，成功制備了效價高達1:5.12×104、半數抑制濃度IC50為61.3ng/mL的FB1多克隆抗血清。⑵在成功制備伏馬菌素 B1人工抗原并且制備出敏感性好，特異性強的鼠源多克隆抗血清的基礎之上，通過單克隆抗體

4、技術成功地進行了小鼠脾細胞與 NS0骨髓瘤細胞的細胞融合，利用間接 ELISA方法和間接競爭 ELISA方法篩選出了1G11和2G12兩株能夠產生 FB1mAb的雜交瘤細胞株，它們的細胞上清效價為1:2.56×104和1:1.28×104。將1G11雜交瘤細胞通過腹腔注射到腹部有石蠟的小鼠體內，使雜交瘤細胞在小鼠體內大量增殖，并分泌特定的單克隆抗體，采集的腹水效價可以達到1:5.12×105。經鑒定，該單克隆抗體的亞型為IgG1型，親和

5、常數 Ka為2.7×1010L/mol，對伏馬菌素B1的半數抑制濃度IC50可以達到6.56ng/mL，并且與其他毒素競爭物的交叉反應率均低于1％。表明試驗獲得了效價、敏感性、特異性和親和力都較為顯著的FB1mAb。⑶通過間接競爭ELISA方法確定了抗原包被濃度為1:1000稀釋，抗體工作濃度為1:30000稀釋，建立了間接競爭 ELISA檢測方法，并且制備了伏馬菌素 B1間接競爭 ELISA快速檢測試劑盒。試劑盒的各項性能良好，其中標