黃曲霉毒素B1和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇誘導錦鯉原代肝細胞凋亡機制的初步研究.pdf

1、霉菌毒素(Mycotoxin)是由霉菌產生的有毒次級代謝產物,各種飼料原料及成品都可能發(fā)生霉變而遭受霉菌毒素的污染。黃曲霉毒素B1(AFB1)是迄今為止人類所知的毒性最強的物質之一,可能對動物機體造成嚴重的傷害。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)又名嘔吐毒素,是一種全球性的谷物污染物,DON的毒性較弱,但污染范圍和含量遠超過其他毒素。根據(jù)對中國飼料及原料中霉菌毒素的調查發(fā)現(xiàn),DON的陽性檢出率為93.0％,平均值為1140 mg·kg-1,檢

2、出率遠高于其他霉菌毒素。AFB1的毒性最強,DON的污染范圍最廣,但目前的研究主要集中在一種毒素對動物機體的影響,多種霉菌毒素間的相互作用機制報道較少,臨床上兩種毒素共同作用于動物機體的現(xiàn)象廣泛存在,兩者之間對動物機體影響的相互關系顯得十分重要。且AFB1和DON對肝臟都具有明顯的毒性作用,本試驗選用錦鯉原代肝細胞,研究AFB1和DON單獨和聯(lián)合作用下,對錦鯉肝細胞形態(tài)學變化、凋亡率、線粒體跨膜電位的變化及凋亡通路相關基因表達的影響,初

3、步探討AFB1和DON誘導錦鯉肝細胞的作用機制,為深入研究AFB1和DON的毒性機理奠定基礎。
　　 試驗一:
　　 本試驗將處于對數(shù)生長期的錦鯉原代肝細胞分別用10和20 ng·mL-1AFB1,125、250、500、1000和2000 ng·mL-1 DON以及10+125、10+250、10+500、20+125、20+250和20+500 ng·mL-1的AFB1+DON(培養(yǎng)基中的毒素終濃度)進行處理。12

4、h后,用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)學變化,流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結果顯示:隨著毒素濃度的增加,對細胞密度及生長狀態(tài)的影響增強；隨著DON濃度的增加,凋亡率逐漸增加；聯(lián)合毒素組,在AFB1存在的條件下,隨著DON濃度的增加,錦鯉肝細胞凋亡率逐漸增加。
　　 試驗二:
　　 本試驗將處于對數(shù)生長期的錦鯉原代肝細胞分別用10和20 ng·mL-1 AFB1,125、250、500、1000和2000 ng·mL-1 DON以

5、及10+125、10+250、10+500、20+125、20+250和20+500 ng·mL-1的AFB1+DON(培養(yǎng)基中的毒素終濃度)進行處理,JC-1染色,用流式細胞儀檢測線粒體跨膜電位。結果顯示:與對照組相比AFB1試驗組線粒體跨膜電位變化差異不顯著,隨著DON濃度(0-500 ng·mL-1)的增加線粒體跨膜電位逐漸降低,AFB1+DON試驗組,在AFB1存在的條件下,隨著DON濃度的增加,線粒體跨膜電位變化逐漸降低,且與

6、DON單獨試驗組相比線粒體跨膜電位變化下降顯著。
　　 試驗三:
　　 本試驗將處于對數(shù)生長期的錦鯉原代肝細胞分別用125、250、500和1000ng·mL-1DON以及10+125、10+250、10+500、20+125和20+250 ng·mL-1的AFB1+DON(培養(yǎng)基中的毒素終濃度)進行處理,作用12h后,提取總RNA,逆轉錄后進行熒光定量PCR。結果顯示:隨著DON濃度的增加,Bcl-2/Bax數(shù)值逐漸降