小麥中隱蔽型脫氧雪腐鐮刀菌烯醇真菌毒素產(chǎn)生規(guī)律及分離純化技術(shù)研究.pdf

1、小麥是中國半數(shù)以上人口的主要食物來源。小麥及其制品的安全性直接關(guān)系到人民的生命安全。小麥、大麥等禾谷類農(nóng)作物生長及儲存過程中容易受到鐮刀菌屬真菌的侵染，產(chǎn)生有毒的次級代謝產(chǎn)物。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON，嘔吐毒素）是其中最常見的真菌毒素，它是食品中最危險自然發(fā)生而污染的真菌毒素之一。然而，研究的進一步深入發(fā)現(xiàn)被禾谷鐮刀菌侵染后的谷物不僅存在游離態(tài)的DON，還有一些隱蔽型的DON，如乙酰化DON（3ADON、15ADON）及DON-β-D

2、-葡萄糖苷（D3G）。這些毒素在常規(guī)的提取過程中易被漏檢，當(dāng)毒素進入人和動物體內(nèi)后會釋放出DO N毒素，成為潛在的食品安全威脅毒素。但由于現(xiàn)在對隱蔽型DON的產(chǎn)生規(guī)律及毒理性研究還處于初級階段，并且D3G毒素的分離純化方式主要通過化學(xué)合成得到的，需要標準品作為合成原料，價格較為昂貴且步驟比較復(fù)雜。因此，本研究對DON、D3G、3ADON、15ADON毒素的產(chǎn)生規(guī)律進行探究，并為D3G毒素的分離純化提供一種新的方式，為后續(xù)研究提供充足原料

3、。
　　本研究首先通過將三株不同禾谷鐮刀菌接種不同狀態(tài)的小麥籽粒（高溫高壓滅菌、8kGy輻照、15kGy輻照）進行培養(yǎng)，摸清隱蔽型 DON的產(chǎn)生條件，確定何種狀態(tài)的小麥籽粒能產(chǎn)生隱蔽型DO N；其次通過室內(nèi)接種實驗及室外大田實驗探究隱蔽型DO N的產(chǎn)生是否與小麥品種、不同禾谷鐮刀菌菌株等因素的關(guān)系，探明不同小麥品種，不同菌株與隱蔽型DON的關(guān)系；最后通過優(yōu)化禾谷鐮刀菌PH-1的產(chǎn)毒條件，確定何種條件下D3G毒素的累積量最高。并通過

4、優(yōu)化提取條件進行，確定快速、大量提取D3 G毒素的方法。本研究為后續(xù)D3G產(chǎn)生機理研究提供理論依據(jù)，為后續(xù)毒理學(xué)研究提供簡便低廉快捷制備標準品的方法。本研究主要內(nèi)容和研究結(jié)果如下：
　　1.本研究為了確定麥粒中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）及其隱蔽型的產(chǎn)生與鐮刀菌菌株、小麥籽粒存活狀態(tài)及培養(yǎng)天數(shù)的關(guān)系，將禾谷鐮刀菌菌株P(guān)H-1、F-1和5035分別人工接種至經(jīng)高溫滅菌、8kGy和15kGy輻照的麥粒中25℃培養(yǎng)7、14、21、28、

5、35d后，通過LC-MS/MS方法測定隱蔽型DON毒素在麥粒中的含量。不同處理的麥粒中DON含量均隨培養(yǎng)時間延長逐漸增加；PH-1接種麥粒培養(yǎng)35d時DON含量最高為624490.25μg/kg。禾谷鐮刀菌接種滅菌麥粒及15kGy輻照麥粒均未檢出D3G毒素；接種8kGy輻照小麥籽粒培養(yǎng)后均可檢出D3G毒素，D3G含量隨著培養(yǎng)天數(shù)延長逐漸降低，F(xiàn)-1接種8kGy輻照麥粒的D3G含量顯著（p<0.05）高于PH-1及5035。F-1接種麥粒

6、培養(yǎng)7d時D3G含量最高為15923.43μg/k g。高壓滅菌小麥由于胚芽被破壞不能發(fā)芽，而高劑量15kGy輻照小麥也不能夠發(fā)芽，而8kGy輻照小麥仍保留了75％-80%的發(fā)芽率，卻能夠較好地去除小麥中存在的背景菌。通過本章實驗我們確定只有禾谷鐮刀菌接種能夠發(fā)芽的麥粒才能產(chǎn)生D3G，而乙?；疍ON的產(chǎn)生不受這一因素制約，這一結(jié)論為后續(xù)的研究提供依據(jù)。
　　2.通過以上研究表明只有8kGy能夠發(fā)芽的小麥才能夠產(chǎn)生 D3G。為了探究

7、不同小麥抗性品種間產(chǎn)生隱蔽型DO N是否存在差異，本部分實驗分為花期前室內(nèi)胚芽鞘接種與室外大田接種兩部分，探究小麥發(fā)育不同時期毒素累積情況。將三株不同禾谷鐮刀菌接種對鐮刀菌具有不同抗性的揚麥15號、揚麥16號、寧麥13號、蘇麥3號（抗性由低到高排列），研究麥粒中毒素累積情況。實驗結(jié)果顯示，室內(nèi)胚芽鞘實驗表明揚麥15號DON毒素含量顯著性（p<0.05）高于蘇麥3號，而揚麥15號D3G毒素含量顯著性（p<0.05）低于蘇麥3號；大田接種實

8、驗中，揚麥15號的病小穗率最高；D3G/總DON與病小穗率具有相關(guān)性，PH-1接種小麥相關(guān)性最高 R2=0.91；通過本章的實驗推測感染禾谷鐮刀菌的小麥 D3 G的累積情況與小麥的抗性有一定關(guān)系。
　　3. D3G是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的一種結(jié)合態(tài)衍生物，可以逃脫常規(guī)的檢測。然而，少量毒理學(xué)研究表明D3G經(jīng)過哺乳動物的胃腸消化道后會釋放出其有毒前體物質(zhì)。為了食品安全檢測及毒理學(xué)實驗提供純化后的D3G，我們嘗試了一種經(jīng)濟和能夠重復(fù)的純

9、化方法。首先，通過將禾谷鐮刀菌菌株P(guān)H-1接種后，在不同溫度和水分活度下培養(yǎng)，確定溫度為25℃、Aw=0.99時，D3 G毒素累積量最高。其次，將接種后小麥粉碎后加入乙腈/水/乙酸提取（79/20/1，v/v/v）經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干。剩余的液體用乙酸乙酯提取，將水層收集后，真空冷凍干燥，經(jīng)后續(xù)純化過程得到 D3 G毒素。通過比較幾種不同提取溶劑，乙腈/水/乙酸提取效果最好，得到最終產(chǎn)品的相對回收率為85%。本實驗利用接種輻照小麥提取 D3G