Il-17F對Wistar大鼠成骨細(xì)胞增殖、ALP活性和Runx2、Osterix mRNA表達(dá)影響.pdf

1、目的：在不同時間點采用不同濃度的IL-17F干預(yù)大鼠原代成骨細(xì)胞，觀察對大鼠原代成骨細(xì)胞的增殖能力和ALP活性的影響，以及對大鼠成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix mRNA的表達(dá)的影響。探討IL-17F對大鼠成骨細(xì)胞增殖和分化功能的作用，觀察成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix以及Runx2 mRNA在IL-17F干預(yù)下表達(dá)的變化，探尋炎癥因子IL-17F在骨形成中的作用，以期為臨床治療骨質(zhì)疏松和相關(guān)骨代謝疾病提供理論依據(jù)。<

2、br>　　方法：
　　1.細(xì)胞提取、培養(yǎng)和鑒定:
　　取出生24小時以內(nèi)Wistar大鼠8只，雌雄不限，采用拉頸法處死，在無菌條件下取其顱骨，分別采用胰酶-膠原酶消化法和組織塊反復(fù)貼壁法提取原代成骨細(xì)胞，37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底面積80％左右時進(jìn)行細(xì)胞傳代，并采用差異貼壁法純化成骨細(xì)胞。采用第4代成骨細(xì)胞進(jìn)行實驗。
　　成骨細(xì)胞的鑒定:
　　(1)采用倒置相差顯微鏡觀

3、察成骨細(xì)胞形態(tài)和生長情況，定期拍照記錄。
　　(2)采用堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)染色法（鈣鈷法）鑒定成骨細(xì)胞。
　　2.實驗分組及處理:
　　將第3代成骨細(xì)胞，胰酶消化、離心后制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105/ml，加入到6孔板中培養(yǎng)24小時。待細(xì)胞貼壁后換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞同步化。將6孔板內(nèi)細(xì)胞隨機(jī)分為對照組和實驗組，對照組采用含10％胎牛血清(F

4、atal bovine serum，F(xiàn)BS)低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，前期預(yù)實驗分別用1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml和100ng/ml的IL-17F干預(yù)成骨細(xì)胞，結(jié)果顯示濃度為20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的IL-17F對成骨細(xì)胞的作用明顯，因此實驗組分別應(yīng)用含有20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml IL-17F的10％FBS低糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。分別在IL-17F干預(yù)后的

5、第1、3天留取細(xì)胞上清液待測，-80℃保存，成骨細(xì)胞進(jìn)行以下檢測。
　　3.指標(biāo)檢測
　　(1)采用CCK-8法檢測成骨細(xì)胞增殖。
　　(2)采用微量酶標(biāo)法檢測成骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALP活性。
　　(3)采用RT-PCR法檢測成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix mRNA的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.成骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定:
　　胰酶-膠原酶消化法和組織塊反復(fù)貼壁法均可獲取大鼠成骨

6、細(xì)胞，其細(xì)胞形態(tài)特征和生長情況符合成骨細(xì)胞特點。通過倒置相差顯微鏡觀察ALP染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞內(nèi)的ALP反應(yīng)生成不溶性染料，呈現(xiàn)黑色顆?；驁F(tuán)塊，證明所培養(yǎng)細(xì)胞為成骨細(xì)胞。
　　2.CCK-8檢測細(xì)胞增殖:
　　與對照組相比，第1天細(xì)胞增殖率實驗組50ng/ml組和100ng/ml組均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，20ng/ml組也有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;第3天實驗組20ng/ml、50ng/ml組和10

7、0ng/ml組均高于對照組(P＜0.05);第5天的實驗組20ng/ml組、50ng/ml組和100ng/ml組細(xì)胞增殖率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　與實驗組20ng/ml組相比，實驗組100ng/ml組在第1、3、5天細(xì)胞增值率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;第3天50ng/ml組和100ng/ml組均高于20ng/ml組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　與實驗組50ng/ml組相比，10

8、0ng/ml組在1、3和5天均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.微量酶標(biāo)法檢測細(xì)胞上清液ALP活性
　　與對照組相比，第1天實驗組20ng/ml和50ng/ml組ALP活性降低，100ng/ml組ALP活性增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;第3天實驗組20ng/ml和50ng/ml組ALP活性較對照組降低，而100ng/ml組ALP活性與對照組、20ng/ml組和50ng/ml組相比均增加，差異具

9、有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.Runx2和Osterix mRNA表達(dá)變化
　　與對照組相比，1、3、5天50ng/ml組和100ng/ml組Runx2mRNA表達(dá)增高(P＜0.05);與實驗組20ng/ml組相比，第1、3天100ng/ml組Runx2 mRNA表達(dá)均增加(P＜0.05)，第5天50ng/ml組和100ng/ml組Runx2 mRNA表達(dá)均升高（P＜0.05）;與50 ng/ml組相比，實驗組1、

10、3、5天100ng/ml組Runx2 mRNA表達(dá)均增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　與對照組相比，實驗組第1、3和5天的50ng/ml組和100ng/ml組Osterix mRNA表達(dá)均明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;第1、3、5天50ng/ml組和100ng/ml組Osterix mRNA表達(dá)高于實驗組20ng/ml組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);各時間點實驗組100ng/ml組Osteri