組織金屬蛋白酶抑制因子-1和脂聯(lián)素對成骨細(xì)胞凋亡與分化增殖的作用機(jī)制研究.pdf

1、第一章組織金屬蛋白酶抑制因子-1蛋白對骨髓基質(zhì)細(xì)胞MBA-1分化和凋亡的作用機(jī)制研究 目的：研究重組組織金屬蛋白酶抑制因子-1(tissueinhibitorofmetalloproteinase-1,TIMP-1)蛋白對前體成骨細(xì)胞-骨髓基質(zhì)細(xì)胞MBA-1凋亡及分化的影響。 方法：堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)的活性用ELISA檢測。骨鈣素(Osteocalcin，OC)用RIA法檢測。細(xì)

2、胞存活率用MTT法檢測；細(xì)胞凋亡用ELISA，流式細(xì)胞分析及吖啶橙/溴乙啶染色檢測。Bcl-2，Bax，caspase-3，cytochromeC，p-JNK，JNK，p-p38，p38，p-ERK1/2，ERK1/2用WesternBlot檢測。PI3-kinasep85α用免疫沉淀法檢測。 結(jié)論：TIMP-1通過PI3-kinase及JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制MBA-1細(xì)胞凋亡。 第二章組織金屬蛋白酶抑制因子-1在調(diào)控M

3、BA-1凋亡與分化中的作用機(jī)制研究 目的：研究組織金屬蛋白酶抑制因子-1(tissueinhibitorofmetalloproteinase-1,TIMP-1)是否通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMP)活性途徑調(diào)控骨髓基質(zhì)MBA-1細(xì)胞凋亡與分化。 方法：用逆轉(zhuǎn)錄酶PCR獲得TIMP-1全長cDNA，T-A克隆TIMP-1全長cDNA，構(gòu)建TIMP-1重組表達(dá)載體及TIMP-

4、1突變體表達(dá)載體，分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞MBA-1，觀察pcDNA3.1TIMP-1及其突變體表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對MBA-1細(xì)胞分化和凋亡的影響。TIMP-1蛋白質(zhì)表達(dá)用WesternBlot檢測?；钚訫MP-2，-9的活性用ELISA檢測。細(xì)胞存活率及凋亡用MTT，ELISA檢測。堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)的活性用ELISA檢測。骨鈣素(Osteocalcin，OC)用RIA法檢測。

5、 結(jié)論：TIMP-1高表達(dá)可抑制MBA-1細(xì)胞凋亡，此作用與其抑制MMPs的抑制活性無關(guān)。TIMP-1通過非MMP途經(jīng)抑制MBA-1細(xì)胞凋亡。 第三章絕經(jīng)后婦女血清組織金屬蛋白酶抑制因子-1和基質(zhì)金屬蛋白酶-1、-2與骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)及骨密度的關(guān)系 目的：探討絕經(jīng)后婦女血清組織金屬蛋白酶抑制因子(TIMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)與骨密度(BMD)及骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)之間的關(guān)系

6、。 方法：用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)測定297名48～80歲女性志愿者的血清TIMP-1、MMP-1、MMP-2、血清骨堿性磷酸酶(serumbonealkalinephosphatase，sBAP)、血清骨鈣素(serumosteocalcin，sOC)和血清Ⅰ型膠原氨基末端肽(serumCross-linkedN-telopeptidesoftypeⅠco

7、llagen，sNTX)，用雙能量X射線吸收測定法(DualEnergyX-rayAbsorptiometry，DXA)測定腰椎正位(anteroposteriorposition，AP)、L1-L4總體、股骨頸、Ward區(qū)和總髖部的BMD。 結(jié)論：(1)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥婦女骨轉(zhuǎn)換率升高，女性血清MMP-2與BMD及骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)(sBAP、sOC、sNTX)相關(guān)，(2)血清MMP-2升高可能為高骨代謝轉(zhuǎn)換過程中的一種生

8、化表現(xiàn)。因此，MMP-2可作為一種新的評價骨代謝轉(zhuǎn)換率的指標(biāo)而應(yīng)用于臨床。 第二部分第一章女性骨密度與年齡、體重指數(shù)及血清骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)的關(guān)系 目的：探討女性骨密度(BMD)與年齡、體重指數(shù)(BMI)及血清骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)-血清骨堿性磷酸酶(serumbonealkalinephosphatase，sBAP)、血清骨鈣素(serumosteocalcin，sOC)和血清Ⅰ型膠原氨基末端肽(serumCross-linked

9、N-telopeptidesoftypeⅠcollagen，sNTX)的關(guān)系。 方法：用ELISA測定591名20～80歲女性志愿者的血清BAP、OC和NTX。用DXA測定腰椎正位(anteroposteriorposition，AP)L1-L4總體、股骨頸、Ward區(qū)、總髖部的BMD。 結(jié)論：(1)婦女絕經(jīng)后骨轉(zhuǎn)換率增加是發(fā)生骨質(zhì)疏松癥的主要原因。(2)年齡、BMI、骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)sBAP、sOC和sNTX是B

10、MD的影響因素。(3)sBAP、sOC、sNTX均為較好的BMD預(yù)測指標(biāo)。 第二章脂聯(lián)素對人成骨細(xì)胞增殖和分化的作用機(jī)制研究 目的：脂聯(lián)素(Adiponectin)是脂肪細(xì)胞特異性分泌的細(xì)胞因子，近期的研究發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞上有脂聯(lián)素受體(Adiponectinreceptor，AdipoR)的表達(dá)，但Adiponectin對成骨細(xì)胞的作用機(jī)制尚未明確。本研究首次探討Adiponectin對人成骨細(xì)胞(HOB)分化及增殖的作用

11、及其機(jī)制。 方法：逆轉(zhuǎn)錄酶PCR及免疫印跡檢測體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的AdipoR表達(dá)。用3H-摻入法檢測成骨細(xì)胞增殖。ALP用ELISA檢測；OC用放射免疫測定法測定；并觀測Adiponectin對礦化的影響。p-JNK，JNK，p-p38，p38，p-ERK1/2及ERK1/2用WesternBlot檢測。用siRNAs(SmallinterferingRNAs)抑制AdipoR1表達(dá)，聯(lián)合MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑U0126，SB2

12、03580和SP600125干預(yù)，以觀察Adiponectin對成骨細(xì)胞分化及增殖作用的變化及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 結(jié)論：Adiponectin通過AdipoR1/JNK、AdipoR1/P38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)人成骨細(xì)胞的增殖及分化。 第三章脂聯(lián)素對人成骨細(xì)胞組織金屬蛋白酶抑制因子-1表達(dá)的作用 目的：在證明高表達(dá)的TIMP-1抑制MBA-1細(xì)胞凋亡以及Adiponectin誘導(dǎo)人成骨細(xì)胞的分化與增殖的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步