結(jié)締組織生長(zhǎng)因子和金屬蛋白酶組織抑制因子-1聯(lián)合RNA干擾研究.pdf

1、目的：結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)在許多組織器官纖維化時(shí)表達(dá)明顯增高，它不僅可直接介導(dǎo)原代肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)活化、增殖及遷移，還能促進(jìn)活化HSC合成及分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracel lular matrix，ECM)。金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，T

2、IMP-1)是近年發(fā)現(xiàn)的一種由巨噬細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞產(chǎn)生，可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)活性的糖蛋白，而MMPs可促進(jìn)膠原纖維降解，是纖維化的抑制因子。所以，減少CTGF和TIMP-1的表達(dá)，可以從不同途徑，減輕纖維化程度。本研究旨在篩選CTGF和TIMP-1的RNA干擾靶位，有效的抑制纖維化。 方法：在GenBank中查詢大鼠CTGF和TIMP-1基因序列，在線設(shè)計(jì)各3個(gè)RN

3、A干擾候選靶位，化學(xué)合成雙鏈RNA(dsRNA)，分別命名為CTGF-1、CTGF-2、CTGF-3、TIMP-1-1、TIMP-1-2、TIMP-1-3，各自轉(zhuǎn)染或不同組合轉(zhuǎn)染經(jīng)TGF-β1刺激活化的大鼠肝星狀細(xì)胞，并設(shè)立陰性對(duì)照組(no-sense)和空白對(duì)照組。每組3復(fù)孔，測(cè)值取均數(shù)。48h后抽提RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA通過(guò)熒光定量PCR測(cè)定CTGF和TIMP-1、procol-α 1mRNACt值，用比較閾值法計(jì)算出procol

4、-α 1、CTGF和TIMP-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算抑制率。并取轉(zhuǎn)染48h后的HSC上清液用放射免疫法(radioimmunoassay，RIA)檢測(cè)肝纖維化指標(biāo)進(jìn)行比較分析。 結(jié)果：熒光定量PCR結(jié)果顯示：CTGF-1組、CTGF-2組、CTGF-3組間相互比較，對(duì)CTGFmRNA表達(dá)均有不同程度的抑制作用，以第三段為靶的“CTGF-3”最佳(CTGFmRNA被抑制率達(dá)68.0996)。CTGF三個(gè)不同靶位RNA干擾與T

5、IMP-1三個(gè)不同靶位干擾聯(lián)合作用后，對(duì)CTGFmRNA的抑制有不同程度增加，其中以二者的第三靶位聯(lián)合干擾對(duì)CTGFmRNA的抑制作用增加最多(CTGFmRNA被抑制率達(dá)76.60％，較單獨(dú)的CTGF第三靶位增加8個(gè)百分點(diǎn))。TIMP-1-1組、TIMP-1-2組、TIMP-1-3組間相互比較，對(duì)TIMP-1 mRNA表達(dá)均有不同程度的抑制作用，也以第三段為靶的“TIMP-1-3”最佳(TIMP-1mRNA被抑制率達(dá)68.55％)。CT

6、GF三個(gè)不同靶位RNA干擾與TIMP-1三個(gè)不同靶位干擾聯(lián)合作用后，對(duì)TIMP-1mRNA的抑制有不同程度增加，其中以二者的第三靶位聯(lián)合干擾對(duì)TIMP-1mRNA的抑制作用增加最多(TIMP-1mRNA被抑制率達(dá)78.05％，較單獨(dú)的TIMP-1第三靶位增加9個(gè)百分點(diǎn))。單獨(dú)的CTGF或TIMP-1所有單個(gè)靶位的RNA干擾，均能減少其下游產(chǎn)物Procol-α 1mRNA的轉(zhuǎn)錄，其中，二者的第三靶位單獨(dú)作用時(shí)效果最好，抑制率分別可達(dá)到65

7、.03％和62.84％；然而，當(dāng)以這兩個(gè)基因不同的靶位組合聯(lián)合進(jìn)行RNA干擾時(shí)對(duì)Procol-α 1mRNA的轉(zhuǎn)錄的抑制作用最強(qiáng)者，是CTGF第二靶位與TIMP-1第三靶位組合，抑制率達(dá)85.79％。肝纖維化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示：?jiǎn)我坏腃TGF和TIMP-1所有靶位的RNA干擾抑制Ⅲ型膠原、HA、LN表達(dá)的比較，分別以第三段為靶的CTGF和第三段為靶的TIMP-1抑制作用最強(qiáng)。CTGF三個(gè)不同靶位RNA干擾與TIMP-1三個(gè)不同靶位干擾聯(lián)合