胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑促進(jìn)前成骨細(xì)胞向成骨分化及其機(jī)制研究.pdf

1、胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide1，GLP-1）是腸道L型細(xì)胞分泌的一種腸促胰島素，主要的生理學(xué)作用包括進(jìn)食后呈葡萄糖依賴性刺激胰島素的分泌和釋放，促進(jìn)胰腺β細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，抑制胰高血糖素分泌，抑制胃排空，促進(jìn)飽食感產(chǎn)生等。但GLP-1在體內(nèi)容易被二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidase-Ⅳ，DPP-Ⅳ）降解，穩(wěn)定性差，無法應(yīng)用于臨床，因此科研人員研發(fā)了多種GLP-1類似物。利拉魯肽與

2、人GLP-1有97％同源，半衰期約12~14小時(shí)；Exendin-4與哺乳動(dòng)物GLP-1的氨基酸序列53%同源，為含有39個(gè)氨基酸的多肽，注射后2小時(shí)就可到達(dá)血藥濃度峰值。由于利拉魯肽和Exendin-4都不會(huì)被體內(nèi)的DPP-Ⅳ降解，因此兩者既克服了天然GLP-1易被降解的缺點(diǎn)，又保留了GLP-1的各種生理作用和治療優(yōu)勢(shì)。利拉魯肽和Exendin-4是目前臨床上常用的降糖藥，不僅可以控制血糖，還可通過多種途徑影響骨代謝。Zhan等研究發(fā)

3、現(xiàn)，GLP-1可以抑制Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor2，Runx2）的產(chǎn)生進(jìn)而抑制小鼠血管平滑肌細(xì)胞的成骨分化。然而，多數(shù)體外研究證實(shí)，GLP-1可以促進(jìn)成骨分化的發(fā)生。因此，GLP-1及其類似物到底是抑制還是促進(jìn)成骨分化尚未定論。
　　Smads是轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)分子。已證實(shí)Wnt/

4、β-catenin和磷脂酰肌醇3-激酶
　　（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）信號(hào)通路均可調(diào)節(jié)Smad2和Smad3的活性和核轉(zhuǎn)移，并參與成骨分化過程。此外，Hedgehog也是影響細(xì)胞分化的重要信號(hào)通路，Hedgehog信號(hào)可使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞選擇性向成骨細(xì)胞分化。
　　為闡述胰高血糖素樣肽-1類似物促進(jìn)前成骨細(xì)胞的成骨分化及其機(jī)制，本研究分四部分：第一部分利拉魯肽促進(jìn)前成骨細(xì)胞向成骨分

5、化；第二部分利拉魯肽對(duì)前成骨細(xì)胞向成骨分化影響的信號(hào)通路研究；第三部分Exendin-4促進(jìn)前成骨細(xì)胞向成骨分化；第四部分Exendin-4對(duì)前成骨細(xì)胞向成骨分化影響的信號(hào)通路研究。
　　第一部分：利拉魯肽促進(jìn)前成骨細(xì)胞向成骨分化
　　目的：
　　明確不同濃度利拉魯肽對(duì)小鼠成樣骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖和分化的影響。
　　方法：
　　1.將體外培養(yǎng)的小鼠成樣骨細(xì)胞MC3T3-E1分為對(duì)照組和干預(yù)組（10-9

6、mol/L利拉魯肽，10-8mol/L利拉魯肽，10-7mol/L利拉魯肽），接種細(xì)胞后第24、48和72h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行CKK-8檢測并利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。
　　2.將普通培養(yǎng)液中培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞設(shè)置為空白對(duì)照組，成骨培養(yǎng)液中培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞設(shè)置為成骨對(duì)照組，成骨干預(yù)組中利拉魯肽濃度分別設(shè)為10-9mol/L、10-8mol/L和10-7mol/L。不同濃度利拉魯肽干預(yù)細(xì)胞48h后進(jìn)行免疫熒光染色定位

7、細(xì)胞GLP-1受體（glucagon-like peptide1 receptor，GLP-1R）的表達(dá)部位；分別取第3、7、14和21天的細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性測定和茜素紅染色半定量測定；利用Western blot分析和Real-time RT-PCR檢測檢測細(xì)胞GLP-1R、Runx2和骨鈣素（osteocalcin，OCN）的mRNA水平和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　

8、　1.利拉魯肽對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞活力和細(xì)胞周期均無顯著影響。
　　2.MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中均存在GLP-1R，利拉魯肽可以增加成骨培養(yǎng)基中MC3T3-E1細(xì)胞GLP-1R的表達(dá)，并具有劑量依賴性；在成骨培養(yǎng)基中加入10-7mol/L利拉魯肽后，14天時(shí)GLP-1R表達(dá)增加最明顯。
　　3.利拉魯肽可劑量依賴性促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化時(shí)的ALP活性和鈣沉積量。
　　4.利拉魯肽上

9、調(diào)Runx2和OCN的mRNA水平和蛋白表達(dá)，并具有劑量依賴性；Runx2的mRNA水平和蛋白表達(dá)在7天達(dá)到峰值，OCN的mRNA水平和蛋白表達(dá)在21天達(dá)到峰值。
　　第二部分：利拉魯肽對(duì)前成骨細(xì)胞向成骨分化影響的信號(hào)通路研究
　　目的：
　　探索Smad2和Smad3是否參與了利拉魯肽促進(jìn)小鼠成樣骨細(xì)胞MC3T3-E1向成骨分化的過程，并進(jìn)一步明確利拉魯肽是否通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路和PI3K-AKT信

10、號(hào)通路調(diào)節(jié)Smad2和Smad3的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。
　　方法：
　　1.將普通培養(yǎng)液中培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞設(shè)置為空白對(duì)照組，成骨培養(yǎng)液中培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞設(shè)置為成骨對(duì)照組，成骨干預(yù)組中利拉魯肽濃度分別設(shè)為10-9mol/L、10-8mol/L和10-7mol/L。利用Real-Time RT-PCR檢測細(xì)胞Smad2和Smad3的基因表達(dá)水平，用Western blot分析技術(shù)檢測p-Smad2、Smad2、p

11、-Smad3和Smad3蛋白表達(dá)水平。
　　2.體外培養(yǎng)小鼠前成樣骨細(xì)胞MC3T3-E1，經(jīng)小干擾RNA（Small interfering RNA，SiRNA）轉(zhuǎn)染以沉默Smad2和Smad3基因表達(dá)。取成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下的MC3T3-E1細(xì)胞隨機(jī)分為8組，分別為空白對(duì)照組、空載體組、空載體+利拉魯肽組、Smad2-SiRNA組、SiSmad2+利拉魯肽組、Smad3-SiRNA組和SiSmad3+利拉魯肽組。利用Real-Ti

12、me RT-PCR檢測細(xì)胞Smad2、Smad3和Runx2的基因表達(dá)水平，用Western blot分析技術(shù)檢測p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3和Runx2的蛋白表達(dá)水平，并通過檢測ALP活性和茜素紅染色及半定量法評(píng)價(jià)細(xì)胞的分化程度。
　　3.我們進(jìn)一步應(yīng)用了 Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑 DKK-1和PI3K-AKT信號(hào)通路抑制劑 LY294002以確定 Wnt/β-catenin信號(hào)通路和P

13、I3K-AKT信號(hào)通路在利拉魯肽對(duì)Smad2和Smad3影響中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.利拉魯肽上調(diào)Smad2和Smad3的mRNA水平，并具有劑量反應(yīng)關(guān)系。
　　2.利拉魯肽可以增加p-Smad2、Smad2、p-Smad2/Smad2、p-Smad3、Smad3和p-Smad3/Smad3蛋白的表達(dá)，并具有劑量反應(yīng)關(guān)系。
　　3.通過SiSmad2或SiSmad3轉(zhuǎn)染抵消了利拉魯肽對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞向

14、成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。
　　4.Wnt/β-catenin信號(hào)通路阻斷劑DKK-1和PI3K-AKT信號(hào)通路阻斷劑LY294002可以抑制利拉魯肽誘導(dǎo)的Smad2和Smad3相關(guān)蛋白的表達(dá)增加。
　　第三部分：Exendin-4促進(jìn)前成骨細(xì)胞向成骨分化
　　目的：
　　明確不同濃度Exendin-4對(duì)小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1向成骨分化的影響。
　　方法：
　　1.將普通培養(yǎng)液中培養(yǎng)的MC3T3

15、-E1細(xì)胞設(shè)置為空白對(duì)照組，成骨培養(yǎng)液中培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞設(shè)置為成骨對(duì)照組，成骨干預(yù)組中Exendin-4濃度分別設(shè)為10-9mol/L、10-8mol/L和10-7mol/L。在誘導(dǎo)后3、7、14和21天，利用 Real-Time RT-PCR和 Western blot分析檢測細(xì)胞GLP-1R的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　2.檢測ALP活性和茜素紅染色及半定量法評(píng)價(jià)細(xì)胞的分化程度，利用Real-Time RT-PCR

16、和Western blot分析檢測細(xì)胞Runx2和OCN的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.Exendin-4可使MC3T3-E1細(xì)胞GLP-1R的mRNA和蛋白表達(dá)水平表達(dá)升高，且呈劑量依賴性。
　　2.MC3T3-E1細(xì)胞 ALP活性和茜素紅染色半定量的OD值隨Exendin-4濃度升高而增加。
　　3.Exendin-4可使MC3T3-E1細(xì)胞Runx2和OCN的mRNA和蛋白表達(dá)水平表達(dá)升高，

17、且呈劑量依賴性。
　　第四部分 Exendin-4對(duì)前成骨細(xì)胞向成骨分化影響的信號(hào)通路研究
　　目的：
　　明確Hedgehog/Gli1信號(hào)通路是否參與調(diào)控了Exendin-4促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞向成骨分化過程。
　　方法：
　　1.利用小干擾RNA（small interfering RNA，SiRNA）轉(zhuǎn)染技術(shù)以沉默Gli1的基因表達(dá)。取成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下的MC3T3-E1細(xì)胞分為6組，空白對(duì)照組

18、、空載體組、Gli1-SiRNA組、空載體+Exendin-4組、Gli1-SiRNA+Exendin-4組。利用Real-time RT-PCR和Western blot分析方法檢測空白對(duì)照組、空載體組和Gli1-SiRNA組中Gli1的表達(dá)水平以確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率，并在第7天檢測所有組的ALP活性和Runx2組的表達(dá)水平，在第21天進(jìn)行茜素紅染色半定量分析。
　　2.應(yīng)用Hedgehog信號(hào)通路抑制劑環(huán)杷明（Cyclopamine）

19、以檢測Gli1的干擾效率以及阻斷效率，并確定Hedgehog/Gli1信號(hào)通路在Exendin-4對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞促成骨分化影響中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.Exendin-4可使MC3T3-E1細(xì)胞Hedgehog和Gli1的mRNA和蛋白表達(dá)水平表達(dá)升高，且呈劑量依賴性。
　　2.SiGli1轉(zhuǎn)染降低了細(xì)胞中Gli1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，并抵消了Exendin-4對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的促

20、進(jìn)作用。
　　3.Hedgehog信號(hào)通路抑制劑環(huán)杷明抵消了Exendin-4對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。
　　結(jié)論：
　　1.利拉魯肽對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖無顯著影響。
　　2.MC3T3-E1細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中存在GLP-1R，利拉魯肽可以增加成骨培養(yǎng)基中MC3T3-E1細(xì)胞GLP-1R的表達(dá)，并具有劑量依賴性。
　　3.利拉魯肽通過Wnt/β-catenin和PI3K-AKT