胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)2型糖尿病糖代謝及胰島β細(xì)胞功能的作用.pdf

1、目的:
　　1、探討胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑利拉魯肽或臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞單用及聯(lián)用對(duì)高糖高脂飼料喂養(yǎng)及腹腔注射小劑量STZ方法誘導(dǎo)的2型糖尿病SD大鼠糖代謝和胰島β細(xì)胞功能的作用及其與炎癥信號(hào)調(diào)控通路機(jī)制間的關(guān)系。
　　2、設(shè)計(jì)前瞻性小樣本臨床研究:為期24周、隨機(jī)、單盲、對(duì)照探討對(duì)利拉魯肽療效欠佳的2型糖尿病患者聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療對(duì)其糖代謝及胰島β細(xì)胞功能的作用。
　　方法:
　　1、以SD大鼠為對(duì)

2、象，采用高糖高脂喂養(yǎng)4周再聯(lián)合腹腔注射30mg/kg STZ的方法制備2型糖尿病模型，檢測(cè)連續(xù)兩次空腹血糖大等于11.1 mmol/L可以判斷為2型糖尿病合格模型大鼠。按照隨機(jī)數(shù)字表的方法將2型糖尿病模型大鼠分為4組:A組（DM對(duì)照組，DM組）;B組（臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療組，hUC-MSCs組）;C組（利拉魯肽治療組，LIRA組）;D組（利拉魯肽和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合治療組，LIRA+hUC-MSCs組）。各組鼠數(shù)均為10只。分別給予相

3、應(yīng)的藥物干預(yù)治療持續(xù)8周，各組具體用藥方案如下。對(duì)照組:尾靜脈注射不含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液100ul;皮下注射生理鹽水2ml，每日兩次。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療組:尾靜脈注射含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液100ul（細(xì)胞數(shù)目5×106）;皮下注射生理鹽水2ml，每日兩次。利拉魯肽治療組:尾靜脈注射不含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液100ul;皮下注射利拉魯肽200ug/kg稀釋液2ml，每日兩次。利拉魯肽和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合治療組:尾靜脈

4、注射含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液100ul（細(xì)胞數(shù)目5×106）;皮下注射利拉魯肽200ug/kg稀釋液2ml，每日兩次。實(shí)驗(yàn)觀察檢測(cè)指標(biāo)為各組實(shí)驗(yàn)大鼠一般狀況;大鼠血清的空腹血糖、糖化血紅蛋白、血清C肽、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽1、胃泌素及膽囊收縮素濃度;大鼠胰腺組織病理學(xué)變化，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胰島素和胰高血糖素的表達(dá);TUNEL法檢測(cè)胰島細(xì)胞凋亡;熒光定量PCR檢測(cè)胰腺組織的NF-κB、TLR4 mRNA的表達(dá)。
　　2

5、、采用隨機(jī)、單盲、對(duì)照的前瞻性臨床研究方法。篩選合格受試者:符合1999年WHO的2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)且病程大于10年，在服用促泌劑、二甲雙胍兩種口服降糖藥并聯(lián)合預(yù)混或基礎(chǔ)胰島素類似物治療（促泌劑日劑量達(dá)藥物最大推薦用量，二甲雙胍日劑量達(dá)1000mg，胰島素日劑量達(dá)20單位）的基礎(chǔ)上并已加用胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑利拉魯肽每日睡前皮下注射1.2mg治療，而且藥物劑量穩(wěn)定并維持用量至少6個(gè)月，但糖化血紅蛋白控制仍未達(dá)標(biāo)（7％≤HbA1c

6、≤10％）。12例合格受試者簽署臨床研究知情同意書，按照隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行隨機(jī)分組:A組（利拉魯肽聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞假移植治療組，LIRA-hUC-MSCs組）和B組（利拉魯肽聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療組，LIRA+hUC-MSCs組）兩組。每組患者例數(shù)均為6例。兩組干預(yù)方案為:利拉魯肽用量仍為1.2mg，每天睡前皮下注射，干預(yù)24周。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植方法:隨機(jī)第1天在干細(xì)胞影像介入室進(jìn)行介入下胰腺動(dòng)脈輸注臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植(細(xì)

7、胞量為1×106/kg);隨機(jī)第8天、第15天和第22天在干細(xì)胞外周靜脈治療室分別進(jìn)行外周靜脈輸注臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植(每次細(xì)胞量為1×106/kg)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞假移植方法:隨機(jī)第1天在干細(xì)胞影像介入室進(jìn)行股動(dòng)脈穿刺輸注等體積生理鹽水;隨機(jī)第8天、第15天和第22天在干細(xì)胞外周靜脈治療室分別進(jìn)行外周靜脈輸注等體積生理鹽水。研究期間定期監(jiān)測(cè)患者一般情況、空腹血糖和糖化血紅蛋白;行75克口服葡萄糖耐量試驗(yàn)及C肽釋放試驗(yàn)評(píng)價(jià)早相C肽分泌

8、功能(△Cp30/△G30)、C肽分泌總量（C肽180min曲線下面積，AUCCP180）和穩(wěn)態(tài)模型法評(píng)估的胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR=FIns×FPG/22.5)。
　　結(jié)果:
　　1、隨機(jī)分組治療前，各組大鼠空腹血糖和糖化血紅蛋白比較無(wú)明顯差異，具有組間基線可比性。分組治療8周末，與糖尿病對(duì)照組比較，三個(gè)治療組大鼠空腹血糖和糖化血紅蛋白均呈明顯降低;與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療組相比較，利拉魯肽治療組以及利拉魯肽和臍帶間充

9、質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合治療組兩組糖化血紅蛋白水平降低更明顯;進(jìn)一步比較利拉魯肽治療組以及利拉魯肽和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合治療組兩組糖化血紅蛋白，提示利拉魯肽和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合治療組大鼠糖化血紅蛋白明顯低于利拉魯肽治療組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、隨機(jī)分組治療8周末對(duì)各組大鼠空腹血清進(jìn)行C肽、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽-1、胃泌素及膽囊收縮素各激素水平檢測(cè)，結(jié)果提示:與糖尿病對(duì)照組比較，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療組C肽明顯升高，胰高血糖素、胰

10、高血糖素樣肽-1、胃泌素和膽囊收縮素差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;利拉魯肽治療組以及利拉魯肽和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合治療組C肽、胰高糖素樣肽-1、胃泌素和膽囊收縮素水平均明顯升高，胰高血糖素的水平降低。與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療組比較，利拉魯肽治療組以及利拉魯肽和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合治療組C肽、胰高血糖素樣肽-1均明顯升高，胰高血糖素的水平降低;與利拉魯肽治療組比較，利拉魯肽和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合治療組C肽和胰高血糖素樣肽-1明顯升高，胰高血糖素明顯降低

11、，胃泌素和膽囊收縮素水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、隨機(jī)分組治療8周末，胰腺組織HE染色形態(tài)比較，提示在微鏡下糖尿病對(duì)照組大鼠胰腺組織形態(tài)紊亂，僅見少量胰島細(xì)胞團(tuán)存在;而三個(gè)治療組大鼠胰腺組織胰島形態(tài)呈現(xiàn)明顯改善，可見較多胰島細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞間排列較緊密，邊界清楚，胞漿豐富;微鏡下觀察三個(gè)治療組胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯差異。進(jìn)一步行免疫組化，就可以觀察到相比較于單用利拉魯肽治療組或臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療組，利拉魯肽和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合治療

12、組大鼠胰腺組織中胰島素陽(yáng)性面積占胰島總面積百分比明顯增高，而胰高血糖素表達(dá)明顯降低。采用TUNEL染色進(jìn)行檢測(cè)大鼠胰腺組織胰島細(xì)胞凋亡，也觀察到相比較于單用利拉魯肽治療組或臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療組，利拉魯肽和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合治療組大鼠胰島細(xì)胞凋亡明顯減輕，而且胰腺組織NF-κB和TLR4基因表達(dá)亦明顯降低。
　　4、共納入合格受試者12例，隨機(jī)分為利拉魯肽聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞假移植治療組和利拉魯肽聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療組兩

13、組，每組各6例，所有患者均按方案完成臨床研究。
　　5、兩組患者基線時(shí)的體重、體重指數(shù)、腰圍、收縮壓及舒張壓等一般情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。治療24周末，與治療前比較兩組患者的一般情況亦未見差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6、兩組患者基線時(shí)的空腹血糖、餐后2h血糖及糖化血紅蛋白比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。與治療基線時(shí)比較，治療24周末利拉魯肽聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞假移植治療組空腹血糖、餐后2h血糖及糖化血紅蛋白的差

14、異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與治療基線時(shí)比較，治療24周末利拉魯肽聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療組空腹血糖、餐后2h血糖及糖化血紅蛋白均呈明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;治療24周末，與利拉魯肽聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞假移植治療組比較，利拉魯肽聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療組空腹血糖、餐后2h血糖及糖化血紅蛋白明顯降低。
　　7、兩組患者基線時(shí)的早相C肽分泌(△Cp30/△G30)、C肽分泌總量(AUCCP180)及胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)比較

15、差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。與治療基線時(shí)比較，治療24周末利拉魯肽聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞假移植治療組△Cp30/△G30、AUCCP180及HOMA-IR的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與治療基線時(shí)比較，治療24周末利拉魯肽聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療組△Cp30/△G30和AUCCP180均呈明顯上升，而HOMA-IR呈明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;治療24周末，與利拉魯肽聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞假移植治療組比較，利拉魯肽聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療

16、組△Cp30/△G30和AUCCP180均呈明顯上升，而HOMA-IR呈明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、與胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑利拉魯肽或臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞單用相比較，兩種方法聯(lián)用對(duì)高糖高脂飼料喂養(yǎng)及小劑量STZ腹腔注射方法誘導(dǎo)的2型糖尿病SD大鼠具有更好地恢復(fù)胰島結(jié)構(gòu)和改善胰島功能，包括胰腺組織胰島病理形態(tài)紊亂明顯好轉(zhuǎn)、免疫組化顯示胰腺組織中胰島素表達(dá)增多而胰高血糖素表達(dá)降低，TUNEL染色結(jié)果同樣

17、顯示胰島細(xì)胞凋亡減輕，從而有效地促進(jìn)C肽分泌、抑制胰高血糖素分泌，同時(shí)改善了胃腸激素胰高血糖素樣肽-1的分泌，以達(dá)到良好的控制糖尿病大鼠血糖和糖化血紅蛋白的作用。利拉魯肽和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合干預(yù)對(duì)糖尿病大鼠糖代謝的改善作用機(jī)制與其下調(diào)了TLR4/NF-κB炎癥信號(hào)通路密切相關(guān)。
　　2、為期24周、隨機(jī)、單盲、對(duì)照的前瞻性小樣本臨床研究結(jié)果顯示對(duì)利拉魯肽療效欠佳的2型糖尿病患者聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植具有更好地改善患者胰島功能包