GLP-1受體非肽類激動劑鎮(zhèn)痛作用及其機制的研究.pdf

1、慢性疼痛是指疼痛持續(xù)時間較長，超過受傷愈合的時間而與引起持續(xù)疼痛的慢性病理過程有關，或經(jīng)數(shù)月或數(shù)年疼痛復發(fā)。根據(jù)發(fā)生的原因不同，慢性疼痛可分為免疫炎癥痛、神經(jīng)病理性痛、癌癥痛、糖尿病性神經(jīng)痛、帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛、艾滋病相關神經(jīng)痛和腰背痛等。慢性疼痛是臨床上最常見的癥狀之一，嚴重影響患者的生活質量。目前臨床上治療慢性疼痛主要包括阿片類藥,局部麻醉藥如利多卡因，三環(huán)抗抑郁藥如阿米替林和抗癲癇藥如加巴噴丁和普瑞巴林。但是由于對慢性疼痛較低的認

2、知度，市場上現(xiàn)有的多數(shù)產品對于慢性疼痛的治療針對性較低，或給藥不方便，對大部分患者無效或只能有限地緩解疼痛，同時可能引起許多不良反應包括嗎啡鎮(zhèn)痛耐受性。因此，發(fā)現(xiàn)安全有效、無耐受成癮性的新型治療慢性疼痛藥物和新靶點分子及其信號通路，是當前神經(jīng)生物學和新藥研究熱點。
　　GLP-1受體是由463個氨基酸組成的跨膜蛋白，屬于蛋白質家族B/G蛋白偶聯(lián)受體。它具有調節(jié)內源性的GLP-1和胃泌酸調節(jié)素合成和分泌的作用。我們實驗室前期工作首次

3、發(fā)現(xiàn)脊髓和皮下給予GLP-1受體肽類激動劑GLP-1和艾塞那肽能夠劑量依賴式地抑制福爾馬林誘導的II相疼痛、腫瘤疼痛、神經(jīng)源性疼痛和糖尿病疼痛，而不影響急性疼痛。我們實驗室進一步發(fā)現(xiàn)，激動小膠質細胞上的GLP-1受體，導致鎮(zhèn)痛遞質β-內啡肽釋放產生鎮(zhèn)痛作用。我們實驗室從而提出假說，脊髓小膠質細胞GLP-1受體/β-內啡肽是一條新的鎮(zhèn)痛靶點通路。
　　采用化學結構與GLP-1和艾塞那肽不同尤其是非肽類GLP-1受體激動劑，有助于進一

4、步證實脊髓小膠質細胞GLP-1受體/β-內啡肽鎮(zhèn)痛通路假說。GLP-1和艾塞那肽是肽類大分子藥物(分子量約為3000-4000 Da)，難以穿過血腦屏障，應用受到限制。GLP-1受體非肽類激動劑具有分子量小，可能可以口服，跨越血腦屏障等優(yōu)點，更具有潛力開發(fā)成為臨床應用的鎮(zhèn)痛藥物。
　　WB4-24為GLP-1受體激動劑Boc5的衍生物，分子量約1000 Da，可能是目前最有效的非肽類正構型GLP-1受體激動劑(活性約在0.2μM)

5、，并具有顯著的降低血糖、體重和飲食作用。藏藥獨一味水提物及其有效成分山梔苷子甲酯(環(huán)烯醚萜苷類化合物)可以抑制福爾馬林疼痛，神經(jīng)源性疼痛和骨癌痛，且其鎮(zhèn)痛作用可被exendin9-39所拮抗。山梔苷子甲酯分子量約300 Da左右，一倍證明為GLP-1受體正構型激動劑。據(jù)此，我們在本課題中研究WB4-24和山梔子苷甲酯鎮(zhèn)痛作用及其作用機制。我們首先探討GLP-1受體非肽類激動劑WB4-24對炎性疼痛的鎮(zhèn)痛作用，觀察給予WB4-24后對模型

6、動物的熱輻射痛和機械性疼痛的影響，并深入研究WB4-24通過激動小膠質細胞中的GLP-1受體，對β-內啡肽的釋放和炎性因子釋放的影響。我們接著探討山梔子苷甲酯對神經(jīng)源性疼痛的鎮(zhèn)痛作用，觀察山梔子苷甲酯對神經(jīng)源性疼痛模型動物的機械性疼痛的影響，并深入研究其鎮(zhèn)痛作用機制是否與激動小膠質細胞p38 MAPK信號轉導通路和釋放β-內啡肽相關，并進一步探討了山梔子苷甲酯自身鎮(zhèn)痛耐受和對嗎啡交叉耐受。
　　動物模型選用福爾馬林，角叉菜膠和完全

7、弗氏佐劑(CFA)引起的急性或慢性炎性疼痛模型和神經(jīng)源性疼痛模型。實驗動物造模成功后，應用熱輻射痛儀或機械痛測痛儀測量疼痛模型的熱輻射痛或機械性疼痛。同時應用實時定量PCR或熒光免疫試劑盒測定β-內啡肽在細胞上清液或和組織中的表達量和釋放量，炎性因子的釋放也應用實時定量PCR進行測定。原代細胞培養(yǎng)過程中，應用了改進的小膠質細胞、神經(jīng)元和星形膠質細胞分離的技術。
　　在小膠質細胞配體結合實驗中，WB4-24與exendin(9-39

8、)-FITC表現(xiàn)出特異性地競爭性結合，在表達人GLP-1受體的HEK293細胞和表達大鼠GLP-1受體的PC12細胞中，WB4-24可以劑量依賴式地使GLP-1-FITC量效曲線右移。鞘內注射WB4-24(0.3，1，3，10，30和100μg)，劑量依賴式對福爾馬林，角叉菜膠，和完全弗氏佐劑(CFA)引起的急性或慢性炎性疼痛表現(xiàn)出良好的鎮(zhèn)痛作用，疼痛抑制率大約為60-80％。但鞘內注射WB4-24對福爾馬林疼痛急性期卻沒有影響。皮下注

9、射WB4-24同樣對完全弗氏佐劑(CFA)引起的炎性疼痛具有良好鎮(zhèn)痛作用，熱輻射痛和機械性疼痛的鎮(zhèn)痛效率分別為52.6%和48.6%。WB4-24激動GLP-1受體引起小膠質細胞β-內啡肽釋放，其β-內啡肽釋放作用可以完全被小膠質細胞抑制劑米諾環(huán)素所拮抗，但WB4-24可以通過激動小膠質細胞 GLP-1受體對炎性疼痛產生鎮(zhèn)痛作用，卻對小膠質細胞炎性因子的釋放沒有影響。另一方面，鞘內注射山梔子苷甲酯(SM)對神經(jīng)源性疼痛也可以產生劑量依賴

10、式的鎮(zhèn)痛作用，ED50為40.0μg，最高抑制率為48.8%。WB4-24和山梔子苷甲酯的鎮(zhèn)痛作用均可以完全被小膠質細胞抑制劑米諾環(huán)素，β-內啡肽抗血清，μ-阿片受體拮抗劑CTAP拮抗，但不能被κ-阿片受體拮抗劑nor-BNI和δ-阿片受體拮抗劑那曲吲哚所拮抗。此外，山梔子苷甲酯也可以激動小膠質細胞，使小膠質細胞釋放β-內啡肽量升高，山梔子苷甲酯的鎮(zhèn)痛作用和刺激β-內啡肽的釋放作用完全被p38MAPK抑制劑SB203580而不能被JNK

11、抑制劑SP600125和ERK抑制劑U0126所拮抗。在鎮(zhèn)痛耐受實驗中，連續(xù)7天給予山梔子苷甲酯不引起自身鎮(zhèn)痛耐受，與嗎啡合用亦不產生交叉鎮(zhèn)痛耐受。
　　上述結果證實了GLP-1受體非肽類激動劑 WB4-24和山梔子苷甲酯對福爾馬林，角叉菜膠，和完全弗氏佐劑(CFA)引起的急性或慢性炎癥疼痛和神經(jīng)源性疼痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用，并且長期連續(xù)給予山梔子苷甲酯可以抑制神經(jīng)源性疼痛，既不會產生自身耐受也不會產生嗎啡交叉耐受，WB4-24和山