蘋果多酚基于GLP-1受體途徑降糖作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是由于胰島素分泌絕對不足或相對不足，引起糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂的疾病，初期血糖、尿糖增高，后期病情發(fā)展合并一系列的心、腎、眼底的微血管病變和神經(jīng)病變、感染和結(jié)核等。在1型和2型糖尿病中，胰島β細(xì)胞功能障礙都是關(guān)鍵的病理生理過程，其中胰島β細(xì)胞凋亡起著重要作用。目前臨床上治療2型糖尿病多采用化學(xué)合成藥治療，這些藥物降血糖的作用強(qiáng)、起效快，但是存在不同程度的副作用，如低血

2、糖、肝腎功能損害，而且不能阻止胰島細(xì)胞的凋亡。因此，尋找療效好、不良反應(yīng)小的新型降糖藥具有極其重要的意義。近年來基于GLP-1受體途徑的腸促胰島素類似物，逐漸進(jìn)入人們的視野并成為最新研究熱點(diǎn)。蘋果多酚(apple polyphenols，AP)是蘋果中天然存在的一類重要生物活性物質(zhì)，其中包括:類黃酮類、單寧類、酚酸類及花色苷等。近幾年大量研究顯示，蘋果多酚具有多種活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗齲齒等功效。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蘋果多酚能夠調(diào)節(jié)RIP1

3、-CRE瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的胰島β細(xì)胞中報(bào)告基因GFP的高表達(dá)，發(fā)揮GLP-1受體激動劑作用。后期選用H2O2誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡，觀察蘋果多酚對胰島β細(xì)胞是否具有保護(hù)作用;通過多次小劑量注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)建立糖尿病小鼠模型，并進(jìn)行蘋果多酚預(yù)防性給藥，來觀察和分析蘋果多酚對糖尿病小鼠的降血糖作用及其基于GLP-1受體途徑的降糖機(jī)制。
　　方法:
　　1、離體細(xì)胞水平
　　1.1 RIP1-CRE

4、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法觀察蘋果多酚對胰島β細(xì)胞中報(bào)告基因GFP表達(dá)的影響，驗(yàn)證其GLP-1受體激動劑的作用。
　　1.2 MTT法觀察蘋果多酚對RIN-m5F胰島β細(xì)胞的增殖的影響。
　　1.3免疫熒光法觀察蘋果多酚對RIN-m5F胰島β細(xì)胞促胰島素釋放的影響。
　　2、MTT法、AO/EB雙染色法觀察蘋果多酚對H2O2作用下RIN-m5F胰島β細(xì)胞活力及凋亡的影響，利用試劑盒測定細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA及SOD含量，并用western

5、 blot法分析細(xì)胞中與凋亡密切相關(guān)的Akt和Caspase-3蛋白表達(dá)的變化，從而明確蘋果多酚基于GLP-1受體途徑抗凋亡的作用靶點(diǎn)。
　　3、整體動物水平:
　　3.12型糖尿病小鼠模型的建立:選取性成年ICR小鼠，多次小劑量腹腔注射STZ建立糖尿病小鼠模型。
　　3.2觀察記錄蘋果多酚預(yù)防性給藥對糖尿病ICR小鼠的體重、攝食量、飲水量、尿量等生理代謝指標(biāo)的影響。
　　3.3測定蘋果多酚預(yù)防性給藥對糖尿病IC

6、R小鼠禁食血糖和非禁食血糖、血脂等生化指標(biāo)的影響。
　　3.4觀察蘋果多酚預(yù)防性給藥對糖尿病ICR小鼠的胰腺系數(shù)的影響。
　　3.5通過HE染色進(jìn)行胰腺組織形態(tài)學(xué)觀察。
　　3.6用胰島素免疫組化分析觀察蘋果多酚對胰腺的細(xì)胞數(shù)量，胰腺質(zhì)量和其組織構(gòu)造的影響，從而評價(jià)蘋果多酚對胰島β細(xì)胞的保護(hù)調(diào)節(jié)作用。
　　3.7利用Western Blot檢測GLP-1受體下游重要分子PDX-1的表達(dá)量，從而確定蘋果多酚基于GL

7、P-1受體途徑對胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。
　　3.8半固體糊法觀察蘋果多酚對糖尿病小鼠腸推進(jìn)和胃排空的影響。
　　結(jié)果:
　　1、離體細(xì)胞水平:
　　1.1蘋果多酚能夠調(diào)節(jié)RIP1-CRE瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的胰島β細(xì)胞中報(bào)告基因GFP的高表達(dá)，發(fā)揮GLP-1受體激動劑作用。
　　1.2 MTT比色法結(jié)果顯示，AP給藥組細(xì)胞活力明顯增加(P＜0.01)，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。
　　1.3免疫熒光結(jié)果顯示，AP

8、給藥組胰島素陽性結(jié)果增加（P＜0.05）。
　　1.4 H2O2誘導(dǎo)下，細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01），AP給藥組較陰性對照組，能較好地改善細(xì)胞存活度(P＜0.01)，且呈一定的濃度依賴性。AO/EB染色法發(fā)現(xiàn)AP組較陰性對照組，細(xì)胞形態(tài)更加完好，凋亡明顯建少。AP還能增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力(P＜0.05)。Western blot分析發(fā)現(xiàn)，較陰性對照組，AP組能增強(qiáng)Akt的表達(dá)(P＜0.05)，降低Caspase-3(P＜0.05

9、)的表達(dá)。
　　2、整體動物水平:
　　2.1各組體重、飲水量、攝食量、尿量比較:模型組小鼠體重較正常組有所下降(P＜0.05)，飲水量、攝食量、墊料濕度明顯增加，而AP給藥組較模型組，體重變化無顯著性差異，但是更很好地降低飲水量、攝食量，改善墊料濕度。
　　2.2各組禁食和非禁食血糖、血脂比較:模型組小鼠禁食及非禁食血糖、血脂較空白組顯著升高（P＜0.05），AP組更顯著降低糖尿病小鼠禁食和非禁食血糖(P＜0.05)

10、，但是對血中甘油三酯、總膽固醇含量無明顯影響。
　　2.3各組胰腺系數(shù)比較:模型組小鼠較空白組胰腺系數(shù)明顯增大(P＜0.05)，AP預(yù)防性給藥組較模型組胰腺系數(shù)顯著降低(P＜0.05)。
　　2.4組織形態(tài)學(xué)觀察:一般病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)同糖尿病模型對照組相比，蘋果多酚給藥組糖尿病小鼠胰島數(shù)量明顯增加，但仍明顯少于正常對照組小鼠。同糖尿病模型對照組小鼠比較，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量有所增加，核固縮和胞漿空泡化減輕。
　　2.5胰島素

11、免疫組化分析:與正常組小鼠相比，糖尿病小鼠胰島素陽性表達(dá)面積減少，胰島β細(xì)胞數(shù)目減少，而蘋果多酚能增加陽性表達(dá)、胰島β細(xì)胞數(shù)目(P＜0.05)。
　　2.6 PDX-1表達(dá)量比較:與正常組小鼠相比，糖尿病小鼠胰腺組織中PDX-1表達(dá)量明顯下降(P＜0.05)，而蘋果多酚給藥組胰腺組織中PDX-1表達(dá)量顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　2.7胃排空及腸推進(jìn):與對照組相比，蘋果多酚能減緩糖尿病小鼠的胃排空(P＜0.05)。

12、　　結(jié)論:
　　蘋果多酚能調(diào)節(jié)RIP1-CRE瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的胰島β細(xì)胞中報(bào)告基因GFP的高表達(dá)，發(fā)揮GLP-1受體激動劑作用。蘋果多酚還對RIN-m5F胰島β細(xì)胞具有促增值、促分泌作用，并且對H2O2誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，其機(jī)制可能與Akt表達(dá)上調(diào)，Caspase-3表達(dá)下調(diào)有關(guān)。
　　蘋果多酚預(yù)防性給藥可以改善多次小劑量注射STZ誘導(dǎo)的糖尿病ICR小鼠模型的非禁食血糖和禁食血糖水平，改善糖尿病I