p58促進(jìn)2型糖尿病發(fā)展及其機(jī)制的研究及GLP-1受體的克隆與表達(dá).pdf

1、2型糖尿病的發(fā)生是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，受環(huán)境和遺傳等多種因素的影響。近期的研究結(jié)果顯示CDC2L2是中國北方漢族人2型糖尿病的易感基因，p58為此基因的一個(gè)編碼蛋白。我們前期細(xì)胞水平的研究結(jié)果顯示p58可通過誘導(dǎo)β細(xì)胞的凋亡促進(jìn)2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展，本研究中我們以建立的2型糖尿病大鼠模型為研究對象，在整體水平上對不同階段的2型糖尿病大鼠胰腺組織中p58及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，從而闡述p58與β細(xì)胞凋亡及2型糖尿病發(fā)生發(fā)展之間的

2、關(guān)系。 研究中，我們利用RT-PCR和WesternBlot方法對不同發(fā)病階段大鼠胰腺組織中p58的mRNA水平和蛋白水平進(jìn)行檢測；利用WesternBlot方法對大鼠胰腺組織中Bcl—2凋亡家族的抑凋亡因子Bcl—2、促凋亡因子Bax及細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(PARP)的剪切體(CleavedPARP，89kD)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示：在2型糖尿病的早、中、后期，即實(shí)驗(yàn)的第17、25和50天(STZ注射第4、12

3、、37日)，2型糖尿病大鼠胰腺組織中p58的mRNA和蛋白水平均明顯升高(P<0.05)；在2型糖尿病發(fā)展后期，即實(shí)驗(yàn)第50日，大鼠胰腺組織中Bcl—2表達(dá)水平下降(P<0.05)，Bax表達(dá)水平升高(P<0.05)，同時(shí)我們還檢測到了CleavedPARP。 凋亡相關(guān)因子Bcl—2、Bax及CleavedPARP的檢測結(jié)果顯示大鼠胰腺組織在2型糖尿病的后期發(fā)生細(xì)胞凋亡；p58的表達(dá)上調(diào)早于凋亡的發(fā)生，提示p58可能誘導(dǎo)β細(xì)胞凋

4、亡的發(fā)生。 以上研究結(jié)果初步揭示了2型糖尿病早期的高糖環(huán)境可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞p58表達(dá)上調(diào)，而上調(diào)的p58通過改變凋亡相關(guān)因子的表達(dá)促進(jìn)β細(xì)胞凋亡，并最終促進(jìn)了2型糖尿病病程的發(fā)展。此外，本結(jié)果在動(dòng)物水平上進(jìn)一步驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)室之前的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。 胰高血糖素樣肽—1(GLP—1)是由小腸L細(xì)胞(Langerhanscell)分泌的生物活性肽，由于其在改善2型糖尿病相關(guān)癥狀中作用顯著，近年來已成為2型糖尿病藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)

5、。GLP—1生物活性的發(fā)揮主要通過其受體(GLP—1R)傳導(dǎo)啟始，因此對GLP—1R的研究同樣具有重要的意義。本研究中我們通過克隆和表達(dá)胰高血糖素樣肽—1受體(GLP—1R)為進(jìn)一步構(gòu)建GLP—1R的真核細(xì)胞系及篩選GLP—1類似物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 首先，在培養(yǎng)的INS—1細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出GLP—1受體的編碼序列。然后將經(jīng)過鑒定的GLP—1RcDNA連接到原核表達(dá)載體pGEX—4T—1和真核表達(dá)載

6、體pCMV-Tag2B中，并進(jìn)行測序鑒定。最后，將獲得的pGEX—4T—1—GLP—1R轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(D3)，經(jīng)異丙基硫代-β—D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后收集菌體蛋白，并通過SDS-PAGE對收獲的融合蛋白進(jìn)行鑒定。 通過上述實(shí)驗(yàn)，我們成功的獲取了GLP—1R的編碼序列，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX—4T—1—GLP—1R和真核表達(dá)載體pCMV-Tag2B—GLP—1R，并使GLP—1R在大腸埃希菌BL21