靶向GLP-1及其受體的抗糖尿病新藥研究以及肥胖性MSG小鼠特征及其發(fā)生高血糖的機(jī)制研究.pdf

1、胰高血糖素樣肽-1(Glucagon like-peptide-1,GLP-1)是20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)的一種腸降糖素,進(jìn)食后由腸道L細(xì)胞分泌,經(jīng)內(nèi)分泌、神經(jīng)及底物刺激等途徑作用于各種胰島細(xì)胞發(fā)揮多種功能,包括刺激胰島素的生物合成和分泌,抑制胰高血糖素的分泌。GLP-1還具有抑制食欲,延緩胃排空,減少肝糖輸出,增加胰島素敏感性等作用。然而GLP-1最突出的優(yōu)點是其降糖作用具有葡萄糖依賴性,不易引發(fā)低血糖；還能夠促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖,抑制其發(fā)

2、生凋亡。盡管如此,GLP-1分泌后很快被二肽基肽酶Ⅳ(DPPⅣ)降解,體內(nèi)半衰期僅有2 min左右,很難應(yīng)用于臨床。由于GLP-1主要由其受體介導(dǎo)發(fā)揮作用,所以為了能更好地發(fā)揮GLP-1的各種抗糖尿病作用,研究者都在積極尋找能夠抵抗DPPⅣ降解的長效GLP-1類多肽和GLP-1受體激動劑。本論文的主要研究目的是:1)評價一種新型GLP-1類多肽BPI3006的DPPⅣ和血漿穩(wěn)定性以及對自發(fā)性2型糖尿病(Type2 diabetesmel

3、litus,T2DM)KKAy小鼠血糖變化的控制效果；2)研究一種新型長效GLP-1受體激動劑E2HSA的抗糖尿病作用和作用機(jī)制；3)研究肥胖性MSG小鼠的特征及其發(fā)生高血糖的機(jī)制。
　　 第一部分新型GLP-1類似物BPI3006的抗糖尿病作用研究
　　 BPI3006是一個采用化學(xué)合成方法將GLP-1 N端第2位肽鍵更換為新取代基團(tuán)的GLP-1類多肽。DPPⅣ和血漿穩(wěn)定性實驗表明,BPI3006具有良好的DPPⅣ耐受

4、性,但血漿穩(wěn)定性較差。報告基因分析表明,BPI3006能夠與GLP-1受體結(jié)合,促進(jìn)cAMP生成,且作用強(qiáng)度與Exendin-4相當(dāng)。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示,BPI3006單次給藥能夠顯著降低正常ICR小鼠口服葡萄糖負(fù)荷后的血糖,并具有良好的量效關(guān)系；能夠降低自發(fā)性T2DM KKAy小鼠的空腹血糖。長期給予BPI3006,每天2次,能夠明顯改善KKAy小鼠的糖耐量異常狀態(tài)和高胰島素血癥,明顯減少其攝食量和飲水量,同時降低其體重。此外,BPI3

5、006系列多肽BPI3007和BPI3008也能夠顯著降低正常ICR小鼠口服葡萄糖負(fù)荷后的血糖,且作用時間較長。
　　 第二部分長效GLP-1受體激動劑E2HSA的抗糖尿病作用研究
　　 E2HSA是一種采用基因工程技術(shù)獲得的Exendin-4串聯(lián)多肽與人血清白蛋白的融合蛋白。E2HSA能夠明顯激活GLP-1受體,刺激cAMP生成,促進(jìn)胰島素基因表達(dá)。它不僅能夠增加NIT-1細(xì)胞的活力,促進(jìn)其增殖,還能夠增強(qiáng)放線菌素D、

6、佛波酯和水溶性膽固醇誘導(dǎo)其損傷后的細(xì)胞活力,減少放線菌素D和水溶性膽固醇誘導(dǎo)的凋亡發(fā)生率,明顯增加胞內(nèi)AKT和PDX-1蛋白的含量。E2HSA單次給藥能夠明顯降低正常ICR小鼠口服葡萄糖負(fù)荷后的血糖,量效關(guān)系良好,作用時間至少為4天;能夠減少正常ICR小鼠的攝食量,降低其體重,延緩其小腸蠕動,作用時間至少為3天。在四氧嘧啶小鼠中長期給予E2HSA能夠明顯降低其禁食和非禁食血糖,增加胰島和血清胰島素水平,減少攝食量和飲水量,降低體重。盡管

7、如此,長期給予E2HSA能夠明顯誘導(dǎo)正常ICR小鼠和四氧嘧啶小鼠產(chǎn)生抗體,抗體滴度至少為1:1000000。
　　 第三部分肥胖性MSG小鼠特征及其發(fā)生高血糖的機(jī)制研究
　　 MSG小鼠的主要特征為向心性肥胖、胰島素抵抗以及糖脂代謝紊亂,是一種典型的代謝綜合癥模型。本實驗室在研究中發(fā)現(xiàn),部分MSG小鼠空腹血糖明顯升高,與糖尿病發(fā)病進(jìn)程中由胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下,胰島代償性分泌胰島素使血糖維持在正常水平,至胰島失代償而出現(xiàn)高血糖

8、的變化極為相似。因此,本文在比較研究MSG小鼠特征的同時,試圖從中找出其發(fā)生高血糖的原因。
　　 生化測定結(jié)果顯示,MSG小鼠胰腺和肝臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)含量減少,甘油三酯(TG)含量增加,高密度膽固醇(HDL)含量降低。與MSG小鼠相比,高血糖MSG小鼠胰腺和肝臟中TG含量明顯增加。免疫組織化學(xué)分析表明,MSG小鼠胰島代償性肥大,胰島α細(xì)胞和β細(xì)胞之間的分布平衡被打破,胰島素和胰高血糖素含量失衡；高血糖MSG小鼠胰

9、島萎縮,形狀不規(guī)則,并且與MSG小鼠相比,胰島素含量明顯減少,胰高血糖素含量增加?；虮磉_(dá)結(jié)果顯示,MSG小鼠胰腺組織中與β細(xì)胞增殖、凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥損傷和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的因子,肝臟組織中炎癥因子、免疫調(diào)節(jié)因子和炎癥通路中NF-κB和JNK,以及脂肪組織中瘦素、炎癥因子和免疫調(diào)節(jié)因子的基因表達(dá)都有不同程度地變化。與MSG小鼠相比,高血糖MSG小鼠胰腺組織中MafA基因表達(dá)的下調(diào),CHOP、IL-6、BAX和BAK基因表達(dá)的上調(diào),以及