大白菜和甘藍(lán)型油菜AP2-ERF家族轉(zhuǎn)錄因子的克隆與分析.pdf

1、植物一生面臨很多的生物和非生物脅迫，嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育，從而影響作物的產(chǎn)量。很多基因被這些脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，以增強(qiáng)植物對逆境的抗性。轉(zhuǎn)錄因子是其中重要的一類調(diào)控基因，通過與順式元件相互作用調(diào)節(jié)植物對各種環(huán)境脅迫的適應(yīng)。AP2/ERF家族是植物中重要的一類轉(zhuǎn)錄因子，包含一個高度保守的AP2-DNA結(jié)合域，其基因編碼的產(chǎn)物具有廣泛的功能。
　　 植物基因組分析是研究基因功能和基因進(jìn)化的有效手段，目前植物基因功能解析很大程度上依賴模式

2、植物擬南芥的研究信息。擬南芥、大白菜和油菜同屬于十字花科，親緣關(guān)系較為密切，因此可以利用擬南芥基因組研究的基因資源和生物信息資源，開展大白菜和油菜的功能基因組研究。本研究分析了大白菜和油菜一類重要的轉(zhuǎn)錄因子AP2/ERF，對于研究大白菜和油菜的逆境抗性、開花機(jī)制和果實發(fā)育等有重要的意義。
　　 1、通過對大白菜EST數(shù)據(jù)庫分析，使用擬南芥AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列信息為探針，得到62個AP2/ERF家族基因?；谶@些大

3、白菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列，可以分為四個亞族（ERF、DREB、RAV和AP2），而且上述亞族的分類與擬南芥非常相似。進(jìn)一步對大白菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了一系列的生物信息學(xué)分析：cDNA和氨基酸序列、組成、理化性質(zhì)、進(jìn)化樹、保守域序列和功能域。通過對EST數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析研究大白菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，上述62個AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員在根中豐度最高，達(dá)到33％，接著是葉和種子，豐度均

4、為21％。芽、花和長果角中的豐度相對較低，分別為：6％、8％和11％。大白菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)量最高的出現(xiàn)在根中，為BraERF-B2-5基因。
　　 2、利用油菜UniGene數(shù)據(jù)庫，通過電子克隆從一個UniGene中分離得到三個AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子（BnaERF1、BnaERF2和BnaERF3）。BnaERF1、BnaERF2和BnaERF3屬于AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子ERF-B2亞族，是親水性蛋白，蛋

5、白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)與AtERF1相似。蛋白質(zhì)無序化分析發(fā)現(xiàn)，油菜BnaERFI、BnaERF2和BnaERF3無序化程度小于擬南芥AtERF1。通過PCR和RT-PCR方法分別從甘藍(lán)型油菜“滬油15”的DNA和eDNA中擴(kuò)增了上述基因，初步分析BnaERF2沒有內(nèi)含子，BnaERF1和BnaERF3有內(nèi)含子。另外，通過EST豐度分析顯示，該類轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)最高峰在種子中，其次為花，在芽、莖和分生組織中沒有檢測到表達(dá)。
　　 3、以擬南芥

6、AP2/ERF-B3亞族轉(zhuǎn)錄因子保守序列為信息探針，分離得到2個油菜AP2/ERF-B3亞族的轉(zhuǎn)錄因子BnaERFB3-1和BnaERFB3-2。通過PCR和RT-PCR方法從甘藍(lán)型油菜“滬油15”的DNA和eDNA中克隆了上述基因。序列分析顯示，克隆的BnaERFB3-1-Hy15和BnaERFB3-2-Hyl5轉(zhuǎn)錄因子都沒有內(nèi)含子，BnaERFB3-1-Hyl5和BnaERFB3-2-Hy15是親水性蛋白，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)與AtERF

7、5相似。BnaERFB3-1-Hyl5和BnaERFB3-2-Hyl5蛋白無序化程度大于擬南芥AtERF5。EST豐度顯示，BnaERFB3-1表達(dá)集中在種子中，而BnaERFB3-2表達(dá)集中在根中。另外，將上述基因分別構(gòu)建入酵母表達(dá)載體和植物雙元表達(dá)載體。
　　 4、以擬南芥AP2/ERF-B4亞族轉(zhuǎn)錄因子保守序列為探針，分離得到一個UniGene( Bna.17538)，進(jìn)一步序列拼接得到一個油菜AP2/ERF-B4亞族轉(zhuǎn)錄

8、因子BnaERFB4-1。分析結(jié)果顯示BnaERFB4-1是親水性蛋白，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)與擬南芥RAP2.6L非常相似，蛋白質(zhì)無序化程度大于擬南芥RAP2.6L。通過PCR和RT-PCR方法分別從甘藍(lán)型油菜“滬油15”DNA和cDNA中分離了BnaERFB4-1基因。序列測定證實BnaERFB4-1-Hyl5基因存在一個內(nèi)含子。將BnaERFB4-1-Hyl5基因通過Barn HI和Sac I酶切后分別插入酵母表達(dá)載體YK3302和植物雙

9、元表達(dá)載體pYF1404，構(gòu)建了BnaERFB4-1-Hy15基因的酵母體內(nèi)結(jié)合和植物轉(zhuǎn)化載體。5、以擬南芥CBF家族轉(zhuǎn)錄因子保守序列為信息探針，搜索油菜UniGene數(shù)據(jù)庫，得到二個UniGene：Bna.2193和Bna.2260，序列拼接得到2個eDNA序列(BnaCBF-1和BnaCBF-2)。通過PCR和RT-PCR方法分別從甘藍(lán)型油菜“滬油15”DNA和cDNA中克隆了上述基因。序列分析顯示，“滬油15”的BnaCBF-1-