楊樹(shù)鹽逆境響應(yīng)基因PtRabA2f的功能研究.pdf

1、小GTP結(jié)合蛋白在真核細(xì)胞中參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞內(nèi)的膜運(yùn)輸?shù)榷喾N過(guò)程。這些蛋白質(zhì)的功能作為分子開(kāi)關(guān)周期性調(diào)節(jié)激活和失活狀態(tài)，該循環(huán)被鏈接到GTP結(jié)合和水解之間。在木本植物中，對(duì)毛果楊中的小G蛋白家族進(jìn)行測(cè)序有114個(gè)成員，分4個(gè)亞家族，其中Rab達(dá)66個(gè)占成員總量的57％。另外，毛果楊小G蛋白家族成員比擬南芥多21個(gè)，這種差異可能是在暗示楊樹(shù)中的小G蛋白家族在功能上的特異性。
　　本試驗(yàn)是對(duì)楊樹(shù)PtRabA2

2、f基因功能的深入研究。通過(guò)RT-PCR方法從毛果楊cDNA中擴(kuò)增得到PtRabA2基因，ORF片段大小為651bp。在構(gòu)建植物表達(dá)載體的時(shí)候，本實(shí)驗(yàn)選擇了使用GateWay技術(shù)。先將目的基因RabA2f與pENTR-SD-D-TOPO中間載體連接，得到中間載體pENTR-RabA2f;再通過(guò)置換的方式將RabA2連接到質(zhì)粒pGWB2上形成pGWB2-RabA2f,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)到毛果楊、擬南芥中，通過(guò)篩選鑒定獲得PtRabA2f

3、超表達(dá)體系毛果楊、擬南芥。
　　通過(guò)對(duì)比WT、pGWB2和T2-PtRabA2f-5擬南芥生長(zhǎng)狀況，在正常平板中T2-P-5組擬南芥長(zhǎng)勢(shì)明顯較好，顯示出鮮重重、植株高、葉片鮮亮且較大、根長(zhǎng)長(zhǎng)等特點(diǎn)，在逆境脅迫下其長(zhǎng)勢(shì)、根長(zhǎng)和鮮重均優(yōu)于pGWB2組和WT組，受脅迫影響小。
　　檢測(cè)毛果楊RabA2f基因表達(dá)特性，以Actin1基因作為內(nèi)標(biāo)基因。使用半定量PCR方法。分別在200mmol/L NaCl、8％PEG、200mmol

4、/L甘露醇、干旱、10mmol/LH2O2脅迫下，與對(duì)照相比PtRabA2f基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯的上升狀態(tài)且每一時(shí)間段都高于WT組和pB2組，在24h表達(dá)量最高。NaCl脅迫處理24h時(shí)，T0-PtRabA2f-3型楊樹(shù)表達(dá)量為WT型的3.54倍;甘露醇脅迫處理24h時(shí)，T0-P-3型楊樹(shù)表達(dá)量為WT型的1.36倍;H2O2脅迫處理24h時(shí)，T0-P-3型楊樹(shù)表達(dá)量為WT型的2.77倍;PEG脅迫處理24h時(shí)，T0-P-3型楊樹(shù)表達(dá)量

5、為WT型的2.37倍;干旱脅迫處理24h時(shí)，T0-P-3型楊樹(shù)表達(dá)量為WT型的2.5倍。
　　對(duì)WT、pB2和T2-PtRabA2f-5組擬南芥各反應(yīng)時(shí)間測(cè)其GTP水解能力變化，結(jié)果顯示當(dāng)處于90min時(shí)GTP水解能力最大。分別在80mmol/L NaCl、8％PEG、200mmol/L甘露醇、10mmol/L H2O2脅迫處理0h、2h、12h、24h時(shí)測(cè)其GTP水解能力變化。結(jié)果顯示T2-PtRabA2f-5超表達(dá)體系擬南芥比

6、野生型擬南芥水解程度高。
　　在80mmol/L NaCl下:T2-PtRabA2f-5組擬南芥葉綠素含量在24h到144h時(shí)呈下降趨勢(shì)，并在144h時(shí)達(dá)到最低值，T2-P-5在144h比對(duì)照提升了15.35％、在168h比對(duì)照提升了17.34％，差異顯著。在8％PEG下:T2-P-5組在144h比對(duì)照提升了25.31％、在168h比對(duì)照提升了26.64％，差異顯著。在200mmol/L甘露醇下:T2-P-5組在144h比對(duì)照提升

7、了24.43％、在168h比對(duì)照提升了25.99％，差異顯著。在10mmol/L H2O2下:T2-P-5在168h比對(duì)照提升了36.33％，差異顯著。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)PtRabA2f基因擬南芥品系在脅迫條件下葉綠素含量更為穩(wěn)定受脅迫影響較小。
　　在80mmol/LNaCl下:T2-PtRabA2f-5組擬南芥電導(dǎo)率比WT和pB組電導(dǎo)率值小，變化緩慢隨著時(shí)間延長(zhǎng)這種趨勢(shì)更明顯，T2-P-5組的電導(dǎo)率含量在24h比對(duì)照降低了6.0

8、1％、在168h比對(duì)照降低了29.81％，差異顯著。在8％PEG下:T2-P-5在24h比對(duì)照降低了6.25％、在168h比對(duì)照降低了27.54％，差異顯著。在200mmol/L甘露醇下:T2-P-5在24h比對(duì)照降低了6.34％、在168h比對(duì)照降低25.21％，差異顯著。在10mmol/L H2O2下:T2-P-5組在48h比對(duì)照降低了4.62％、在168h比對(duì)照降低了28.67％，差異顯著。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)PtRabA2f基因擬南