青花菜MYB28、MYB29基因克隆與功能分析.pdf

1、脂肪族芥子油苷（aliphatic glucosinolates，AGSL）是一種廣泛存在于十字花科植物中的含氮、含硫的植物次生代謝產(chǎn)物，其降解產(chǎn)物（如蘿卜硫素）不僅在植物防御、響應(yīng)生物或非生物脅迫的生理過程中具有重要的作用，而且還具有極強(qiáng)的抗癌活性。MYB28和MYB29是調(diào)控脂肪族GSL生物合成的兩類重要轉(zhuǎn)錄因子，其功能已在模式植物擬南芥中研究的較為清楚。在十字花科蔬菜中，青花菜中的芥子油苷含量最為豐富，成分更為復(fù)雜，目前國內(nèi)外對青

2、花菜 AGSL生物合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因研究的較多，而對其中起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子的研究則相對較為滯后。本研究以高蘿卜硫素青花菜“福青1號”為材料，克隆了MYB28和MYB29兩種轉(zhuǎn)錄因子，并對其表達(dá)模式以及功能進(jìn)行初步了分析，主要研究結(jié)果如下：
　?。?）通過同源克隆的方法，克隆出青花菜脂肪族芥子油苷合成調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子MYB28的2個同源基因（BoMYB28-1、BoMYB28-2）和MYB29的2個同源基因（BoMYB29-1和Bo

3、MYB29-2）。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這四個轉(zhuǎn)錄因子核苷酸序列與其他物種同類基因的同源性較高，均含有明顯的MYB家族R2R3型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)，初步確定它們?yōu)榍嗷ú薆oMYB28和BoMYB29基因。上述四個轉(zhuǎn)錄因子提交至 GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號分別為：KM262765.1、KM262766.1、KM262767.1和KM262768.1。
　?。?）分別構(gòu)建了BoMYB28-1、BoMYB28-2、BoMYB29-1和BoMY

4、B29-2基因的亞細(xì)胞定位載體，并進(jìn)行瞬時表達(dá)，結(jié)果顯示在洋蔥表皮細(xì)胞核中均出現(xiàn)明顯的綠色熒光，表明BoMYB28-1、BoMYB28-2、BoMYB29-1和BoMYB29-2基因定位于細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子基因。
　　（3）熒光定量PCR分析結(jié)果表明，四個同源基因在青花菜不同組織中基因的表達(dá)量存在顯著差異。其中BoMYB28-1在花球中表達(dá)量最高，約是根中的100倍，隨著莖、葉和花逐漸降低。在種子中BoMYB28-1的表達(dá)量幾乎檢

5、測不到。BoMYB28-2基因在莖中表達(dá)最高，較根中的表達(dá)量略高?；ㄇ蚝突ㄖ械谋磉_(dá)量略少于根，在葉中的表達(dá)量很少，種子中幾乎見不到表達(dá)。BoMYB29-1基因的表達(dá)量在花球中的最高，約是根中表達(dá)量的6倍，莖和葉中的表達(dá)量相似，略低于花球，在種子中的表達(dá)量較根略高。BoMYB29-2基因的表達(dá)在花球中的表達(dá)量最高，大約是根中的3倍，在莖中的表達(dá)量較花球中略低，隨著葉、根和花逐漸降低，在種子中幾乎檢測不到基因的表達(dá)量。用MeJA和蔗糖對青花

6、菜進(jìn)行脅迫處理分析發(fā)現(xiàn)，四個同源基因的表達(dá)量隨著處理的時間延長逐漸增加，并分別在15 min和2 h時達(dá)到最高，隨后表達(dá)量逐漸降低至初始狀態(tài)。
　?。?）構(gòu)建了四個同源基因的過量表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，分別獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著轉(zhuǎn)錄因子BoMYB28-1、BoMYB28-2、BoMYB29-1和BoMYB29-2基因表達(dá)量的增加，脂肪族芥子油苷的含量有了顯著改變。其中，在BoMYB28-1和BoMYB28-