日本三角渦蟲肌肉發(fā)生決定因子DjMDF基因的克隆及再生過程中的表達(dá)分析.pdf

1、渦蟲,扁形動(dòng)物門(Platyhelminthes)渦蟲綱(Turbellaria)動(dòng)物.渦蟲是真正三胚層動(dòng)物的開始,有內(nèi)胚層、外胚層和中胚層以及三胚層分化形成的器官和組織.渦蟲再生能力極強(qiáng),不論是縱切、斜切、橫切,甚至將渦蟲切割成279段,切割后每一部分都具有再生出所有缺失組織的能力.渦蟲強(qiáng)大的再生能力使其成為研究再生機(jī)制、細(xì)胞分化和模式建成的模式生物.對(duì)渦蟲的研究多集中于渦蟲損傷后神經(jīng)系統(tǒng)再生機(jī)制、體軸重建機(jī)制和全能干細(xì)胞neobla

2、sts干細(xì)胞特性的維持等方面,渦蟲肌肉發(fā)生過程的分子調(diào)控機(jī)制研究甚少.脊椎動(dòng)物、爪蟾、果蠅、線蟲、文昌魚等肌肉發(fā)生機(jī)制研究較多,研究表明MyoD基因家族在肌肉發(fā)生過程發(fā)揮重要作用.
　　本文用生物軟件MegAlign比對(duì)已知MyoD家族cDNA序列保守區(qū),根據(jù)比對(duì)結(jié)果設(shè)計(jì)基因特異性引物，PCR擴(kuò)增得到日本三角渦蟲肌肉發(fā)生決定因子DjMDF保守區(qū)cDNA序列.利用RACE技術(shù)在已知cDNA片段的基礎(chǔ)上,通過向3'端和5'端延伸擴(kuò)增的

3、方法,獲得DjMDF cDNA序列全長.用生物軟件推測DjMDF的氨基酸序列,并對(duì)該氨基酸序列作序列比對(duì)分析和進(jìn)化分析.在已知的DjMDF cDNA序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物,用體外轉(zhuǎn)錄的方法得到原位雜交的正義探針和反義探針,斑點(diǎn)雜交確定探針使用濃度及抗體使用濃度.整體原位雜交技術(shù)檢測切割后再生24h、36h、48h、72h、5day、7day、2week的日本三角渦蟲DjMDF基因mRNA表達(dá)水平的變化,從而確定DjMDF基因在渦

4、蟲肌肉發(fā)生中發(fā)揮作用.
　　日本三角渦蟲肌肉發(fā)生決定因子DjMDF基因cDNA序列全長為1558bp,包括29bp的5’非編碼區(qū),1422bp的開放閱讀框(ORF),107bp的3’非編碼區(qū)(3’-UTR).根據(jù)ORF區(qū)序列用Editsequence軟件推測出DjMDF編碼的蛋白,為474個(gè)氨基酸的DjMDF蛋白.該氨基酸序列中230-314位為bHLH結(jié)構(gòu)域中的basic domain,序列中315-366位氨基酸為helix-

5、loop-helix domain.將得到的DjMDF的氨基酸序列與人、小鼠、果蠅、線蟲、爪蟾等MyoD家族進(jìn)行序列比對(duì),結(jié)果表明DjMDF與其它MyoD家族成員一樣都有一保守的bHLH結(jié)構(gòu)域.由于MyoD家族是通過保守區(qū)形成同源或者異源二聚體,結(jié)合在靶基因的啟動(dòng)子上發(fā)揮功能,調(diào)節(jié)與肌肉發(fā)生相關(guān)的基因表達(dá),由此推測進(jìn)化上保守的DjMDF,與其他MyoD家族一樣參與肌肉發(fā)生的調(diào)控.
　　半定量PCR表明,在切割后再生渦蟲中DjMDF

6、表達(dá)水平較高,再生初期隨時(shí)間推移DjMDF表達(dá)逐漸上升,再生36h達(dá)到最高值,隨后DjMDF表達(dá)水平逐漸下降,但均高于正常渦蟲中該基因的表達(dá)水平.
　　整體原位雜交結(jié)果表明,DjMDF主要在有肌肉發(fā)生過程的細(xì)胞或者組織中表達(dá).在再生尾部的頭段藍(lán)色信號(hào)首先在間質(zhì)細(xì)胞中出現(xiàn),隨再生進(jìn)行、咽部形成,藍(lán)色逐漸向后集中到咽形成區(qū),也就是DjMDF表達(dá)逐漸集中于形成咽的部位;在再生頭部的尾端，DjMDF表達(dá)類似頭段,首先在間質(zhì)細(xì)胞中出現(xiàn),逐漸