日本三角渦蟲Spsb基因的克隆及表達分析.pdf

1、SPSB蛋白家族由四個高度保守的成員（SPSB1-SPSB4）組成，共同特征是其氨基酸包含SPRY結構域和羧基(C)端的SOCS-box基序。雖然在高等動物和一些無脊椎動物中已克隆了Spsb基因并對其表達模式進行了分析，但是，到目前為止，這些基因確切的功能尚不清楚。本研究以日本三角渦蟲（Dugesia japonica）為實驗材料，克隆了DjSpsb基因的全長cDNA序列并對其表達模式進行了系統(tǒng)分析，結果如下：
　　1、利用RAC

2、E技術首次在日本三角渦蟲中克隆了Spsb基因的全長cDNA序列。DjSpsb基因的cDNA全長為1251 bp，包含一個105 bp的5'端非翻譯區(qū)(5'UTR)和一個87 bp的3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)。其中3'端非翻譯區(qū)包含一個poly(A)尾和一個終止密碼子。最大開放閱讀框(ORF)為1059 bp，編碼一個由352個氨基酸殘基組成的蛋白質。
　　2、利用ExPASy，TMHMM2.0、SMART、InterPro等其他

3、在線軟件對該基因所推導的氨基酸序列進行生物信息學分析，結果表明:DjSPSB蛋白的分子量為40.90 kDa，理論等電點為9.04，含有一個保守的SPRY結構域和一個SOCS盒，為親水性核蛋白，存在多個磷酸化位點，無信號肽且不存在跨膜區(qū)。
　　3、根據該基因所推導的氨基酸序列利用用貝葉斯MrBayes3.1.2構建了系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)進化分析表明DjSpsb在多細胞動物進化過程中高度保守，且與Spsb1，Spsb2和Spsb4有較高

4、的同源性。
　　4、利用整體原位雜交、切片原位雜交和實時熒光定量PCR技術研究了DjSpsb基因在整體及再生渦蟲中的時空表達模式。結果表明:在性未成熟的整體渦蟲中，DjSpsb主要在頭部表達且邊緣部位陽性信號較強，此外，DjSpsb在神經組織和腸支表達;在性成熟的個體中，陽性信號主要在頭部、睪丸和卵黃腺部位表達，卵巢部位不表達;在再生個體中，陽性信號在再生胚基表達。RT-PCR結果顯示，在尾再生頭部分，DjSpsb基因在切割后1，