日本三角渦蟲(chóng)Djwnt1基因的克隆及再生過(guò)程中的表達(dá)分析.pdf

1、渦蟲(chóng)屬于扁形動(dòng)物門(Platyhelminthes)渦蟲(chóng)綱(Turbellaria),在動(dòng)物進(jìn)化進(jìn)程中出現(xiàn)了一系列發(fā)育上的關(guān)鍵性變化.渦蟲(chóng)具有強(qiáng)大的再生能力,對(duì)其再生機(jī)制等方面的研究一直是發(fā)育生物學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題.Wnt信號(hào)途徑是動(dòng)物發(fā)育中關(guān)鍵的信號(hào)途徑之一,對(duì)生物的生長(zhǎng)發(fā)育有著至關(guān)重要的作用,Wnt信號(hào)途徑調(diào)節(jié)影響著許多生命過(guò)程,包括細(xì)胞形態(tài)與功能的分化與維持、動(dòng)物胚胎軸方向的形成、免疫、細(xì)胞癌變與細(xì)胞凋亡等.wnt基因?qū)ι锏陌l(fā)育有

2、著至關(guān)重要的作用,近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)渦蟲(chóng)的wnt基因進(jìn)行了不斷的深入研究,研究技術(shù)越來(lái)越成熟.
　　本文根據(jù)日本三角渦蟲(chóng)Djwnt1基因cDNA部分序列和地中海渦蟲(chóng)的Smed-wnt1基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物,采用RACE技術(shù)克隆得到日本三角渦蟲(chóng)Djwnt1基因的全長(zhǎng)cDNA,并對(duì)其編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析;采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)了Djwnt1在日本三角渦蟲(chóng)中的表達(dá)情況.已有報(bào)道顯示,Djwnt1與渦蟲(chóng)尾部的再生有關(guān),本文

3、用庚醇處理渦蟲(chóng),破壞細(xì)胞間隙連接,觀察渦蟲(chóng)的再生情況,并通過(guò)原位雜交技術(shù),檢測(cè)渦蟲(chóng)體內(nèi)Djwnt1的表達(dá)變化.
　　Djwnt1 cDNA全長(zhǎng)1632 bp,由72 bp的5'非編碼區(qū)(5'-UTR),1263 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)和297 bp的3'非編碼區(qū)(3'-UTR)組成,其中ORF區(qū)編碼420個(gè)氨基酸的Djwnt1蛋白,在3'-UTR末端含有attaaa的加尾信號(hào)和24 bp的poly(A)序列.Djwnt1氨基酸

4、序列是由25個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽,64個(gè)氨基酸殘基的非功能區(qū)和331個(gè)氨基酸殘基的功能肽組成的.Djwnt1含有24個(gè)保守的半胱氨酸殘基,結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明,這些半胱氨酸之間可以形成鏈內(nèi)二硫鍵,從而形成短的發(fā)卡結(jié)構(gòu).
　　序列比對(duì)表明日本三角渦蟲(chóng)Djwnt1與地中海渦蟲(chóng)Wnt1的氨基酸序列之間的相似性最高,為85.2％,而與哺乳動(dòng)物、魚(yú)類、爪蟾和其他無(wú)脊椎動(dòng)物Wnt1之間的相似性相對(duì)較低;在進(jìn)化樹(shù)中,哺乳動(dòng)物、兩棲類動(dòng)物和魚(yú)類處于同一個(gè)

5、分支上,說(shuō)明哺乳動(dòng)物、兩棲類動(dòng)物和魚(yú)類的同源關(guān)系較近;渦蟲(chóng)與?？退Ｌ幵谕粋€(gè)分支上,其中,渦蟲(chóng)與水螅進(jìn)化關(guān)系最近,wnt1基因相似度為34.1％.
　　原位雜交表明,在完整渦蟲(chóng)中,Djwnt1表達(dá)于中軸線靠后的細(xì)胞中.切斷渦蟲(chóng)后,Djwnt1在損傷早期約12 h表達(dá)于損傷部位,在面向前端的損傷處和面向后端的損傷處都有表達(dá).48 h后,面向前端的損傷處和面向后端的損傷處Djwnt1的表達(dá)有了變化,面向后端損傷處Djwnt1表達(dá)持

6、續(xù)不變,且開(kāi)始聚集于背中線的后極;而Djwnt1在48 h之后在面向極性前端損傷處的不再明顯表達(dá).用庚醇處理渦蟲(chóng)后,再生過(guò)程比對(duì)照組要延長(zhǎng)一周左右.原位雜交表明,Djwnt1在損傷處的表達(dá)延遲約24 h.在36 h時(shí)有Djwnt1表達(dá)于損傷部位,72 h時(shí)在面向極性后端損傷處 Djwnt1表達(dá)持續(xù)不變,且開(kāi)始聚集于背中線的后極,而Djwnt1在面向極性前端損傷處表達(dá)量開(kāi)始下降.96 h時(shí)Djwnt1在面向極性后端的損傷處聚集在背中線的后