hsbp1基因的克隆、表達(dá)及在肝再生中的作用分析.pdf

1、本文研究目的：采用抑制性消減雜交技術(shù)(SSH)從短間隔連續(xù)部分肝切除(SISPH)文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)諸多可能代表肝再生中差異表達(dá)的基因的ESTs片斷，生物信息學(xué)分析表明一個(gè)EST與人和小鼠hsbp1cDNA序列有很高的相似性，研究該基因的結(jié)構(gòu)和功能。 　　研究方法：以hsbp1基因的EST為依據(jù)合成探針，用Southern方法從再生肝全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)中篩選目的基因；用電子克隆進(jìn)行基因的染色體定位；用Genscan分析基因的結(jié)構(gòu)；用Nucleo

2、tide-nucleotideBLAST(NCBI)進(jìn)行基因的同源性分析；用EXPASYMolecularBiologyServer進(jìn)行蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)和修飾加工預(yù)測(cè)；將cDNA的ORF區(qū)與pGEX-2TK連接構(gòu)建原核表達(dá)載體；用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)；用GlutathioneSepharose4B親和層析方法純化融合蛋白；用純化蛋白免疫家兔，制備多克隆抗體；用基因表達(dá)譜芯片、RT-PCR、原位雜交分析肝再生中mRNA的含量變化動(dòng)態(tài)；

3、用原位雜交分析胚胎中的HSBP1分布和含量。 　　研究結(jié)果：克隆的hsbp1cDNA全長(zhǎng)為1147bp，并獲得GeneBank登陸號(hào)AF522937；hsbp1位于大鼠染色體19q12，由6個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成，其ORF含有228bp，起始密碼子ATG位于36～38核苷酸處，終止密碼子TGA位于264～266核苷酸處，編碼76個(gè)氨基酸；HSBP1廣泛存在血液、骨骼、大腦、眼睛、心臟、腎臟、肝臟、肺、肌肉、皮膚、胰腺、外周神經(jīng)、軟組

4、織、胃、舌、子宮中，且在進(jìn)化中高度保守；HSBP1蛋白可能形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，沒(méi)有正向或反向的跨膜區(qū)域，有2個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)；表達(dá)和純化的GST-HSBP1融合蛋白分子量為8kD；HSBP1mRNA的含量高峰出現(xiàn)在6h和144h的再生肝中和第八天大鼠原腸胚中。 　　研究結(jié)論：hsbp1位于大鼠染色體的19q12，由7個(gè)內(nèi)含子和6個(gè)外顯子組成；HSBP1在進(jìn)化中非常保守；HSBP1廣泛存在血液、骨骼、大腦、眼睛、心臟、腎臟、肝臟、肺、肌