PtIAA1和PtABP1基因的克隆及其在楊樹中的表達(dá).pdf

1、木材形成是一個受到基因編碼嚴(yán)格調(diào)控的復(fù)雜的生物學(xué)過程。若通過分子育種技術(shù)來改良木材品質(zhì)，需首先深入了解木材形成過程的分子機(jī)制，即研究控制木材形成的關(guān)鍵基因及其相互作用機(jī)制，以實(shí)現(xiàn)有目的地進(jìn)行分子育種設(shè)計，最終達(dá)到調(diào)控木材形成、改良木材品質(zhì)的目的。生長素在形成層活動和維管組織分化中起著極其重要的調(diào)控作用，包括：控制形成層活動周期，維持紡錘狀細(xì)胞的形態(tài)和排列方向，控制木質(zhì)部和韌皮部的分化。先前在模式植物擬南芥中的研究初步表明，生長素結(jié)合蛋白

2、(AuxinBindingProtein，ABP)和生長素響應(yīng)蛋白(AuxinResponseProtein，ARP)可通過調(diào)控生長素的轉(zhuǎn)運(yùn)來實(shí)現(xiàn)有效控制木材維管系統(tǒng)發(fā)育和分化。為了研究在木本植物中生長素與形成層活動和次生維管組織形成的關(guān)系，本研究利用RT-PCR方法，克隆了2個與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)的基因，通過組織特異性表達(dá)分析和基因工程技術(shù)來研究這2個基因在楊樹中的表達(dá)模式，初步揭示了其對形成層活動和次生維管組織的影響。得到如下主

3、要結(jié)論： 1.Aux/IAA基因在生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中具有重要作用。利用RT-PCR方法，首次從毛白楊形成層cDNA中分離出PtIAA1cDNA，并進(jìn)行了測序和序列分析。結(jié)果表明，克隆的毛白楊PtIAA1cDNA片段總長為764bp，基因內(nèi)部含有完整的開放閱讀框架，大小為606bp，可編碼長度為201個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，利用RT-PCR方法，研究了其組織特異表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)該基因在形成層區(qū)域表達(dá)量最高，未成熟木質(zhì)部次

4、之，成熟木質(zhì)部較低，在根部表達(dá)豐度很低，而在韌皮部中則幾乎沒有檢測到PtIAA1基因的表達(dá)。為了研究PtIAA1基因?qū)π纬蓪踊顒雍痛紊S管組織形成的影響，以pBI121為載體，分別構(gòu)建了該基因的正、反義表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法，將構(gòu)建好的基因?qū)霔顦渲?，?jīng)PCR檢測和Southern雜交實(shí)驗表明，本研究得到了該基因的正、反義楊樹轉(zhuǎn)化植株。定量PCR檢測顯示，該基因在轉(zhuǎn)化和野生型植株中表達(dá)有明顯差異。在此基礎(chǔ)上，通過表型觀察，發(fā)現(xiàn)

5、PtIAA1正義轉(zhuǎn)化植株的高生長明顯低于對照植株，且地徑小于對照植株。相反PtIAA1反義轉(zhuǎn)化植株的地徑明顯大于對照植株，而且莖發(fā)生嚴(yán)重彎曲。對楊樹莖橫切面進(jìn)行切片觀察發(fā)現(xiàn)，PtIAA1反義轉(zhuǎn)化植株形成層區(qū)域明顯變寬，而正義轉(zhuǎn)基因植株則變窄，初步表明PtIAA1可能參與了形成層細(xì)胞的分裂和分化。 2.ABP1是可能的生長素受體，在植物生長發(fā)育過程中有著重要的作用。本研究利用RT-PCR方法，首次從毛白楊形成層cDNA中分離出Pt

6、ABP1cDNA序列，并進(jìn)行了測序和序列分析。結(jié)果表明，克隆的毛白楊PtABP1cDNA片段總長度為699bp，基因內(nèi)部含有完整的開放閱讀框架，大小為585bp，可編碼長度為194個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。依據(jù)序列分析結(jié)果，在編碼區(qū)設(shè)計序列特異的引物，通過原位雜交和原位RT-PCR研究其組織表達(dá)情況，結(jié)果顯示PtABP1主要在形成層區(qū)域表達(dá)，而韌皮部、木質(zhì)部表達(dá)水平非常低。為了研究PtABP1在木本植物中的表達(dá)模式，以pBI121為載體，構(gòu)

7、建了該基因的正義表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法，將構(gòu)建好的基因?qū)霔顦渲?，?jīng)PCR檢測和Southern雜交實(shí)驗表明，得到了該基因的轉(zhuǎn)化植株。定量PCR檢測顯示，該基因在轉(zhuǎn)化和野生型植株中表達(dá)有明顯差異。表型觀察和解剖結(jié)構(gòu)分析表明，與對照相比，沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株有明顯的表型差異，但在解剖結(jié)構(gòu)上顯示，轉(zhuǎn)基因楊樹木質(zhì)部纖維細(xì)胞的直徑明顯加大，而細(xì)胞壁明顯變薄。方差分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因楊樹和對照植株木質(zhì)部纖維細(xì)胞的細(xì)胞直徑和細(xì)胞壁厚度均達(dá)到