大鼠再生肝的陷窩細(xì)胞基因表達(dá)譜分析及其opn的作用研究.pdf

1、肝臟是人體的重要器官之一,其強(qiáng)大的再生能力亦為學(xué)者重視。人們通常以Higgins和Anderson建立的大鼠2/3肝切除手術(shù)誘導(dǎo)的再生肝組織材料為對(duì)象研究肝再生分子機(jī)理。但肝臟由多種細(xì)胞組成,肝再生中各種肝臟細(xì)胞的生理、生化活動(dòng)顯著不同,肝再生進(jìn)程一般受到肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間的信號(hào)協(xié)調(diào)支配。因此將再生肝的各種細(xì)胞分離出來(lái)分別進(jìn)行研究,將會(huì)使研究結(jié)果更加明晰、簡(jiǎn)化。陷窩細(xì)胞(pit cell)是肝臟特異的自然殺傷細(xì)胞,不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞

2、和病毒感染的肝細(xì)胞有直接殺傷作用,還參與調(diào)控肝再生的程度。盡管關(guān)于陷窩細(xì)胞在肝臟重建方面的功能有所闡述,但目前缺乏轉(zhuǎn)錄水平上深入研究陷窩細(xì)胞與肝再生的具體關(guān)系的研究。
　　 為從基因轉(zhuǎn)錄水平系統(tǒng)研究陷窩細(xì)胞在肝再生中作用,本研究按Higgins等方法制作大鼠部分肝切除(partial hepatectomy,PH)模型,用兩步灌流法分散肝臟細(xì)胞,用60％的pereoll密度梯度離心和免疫磁珠分離肝陷窩細(xì)胞,用real-time

3、RT-PCR定量陷窩細(xì)胞的CD8和CD56 mRNA,用蛋白免疫印跡方法定量陷窩細(xì)胞的CD8和CD56蛋白。初步證實(shí),從PH后各時(shí)間點(diǎn)分離的肝陷窩細(xì)胞成活率均在96％以上,CD8和CD56陽(yáng)性細(xì)胞占95％以上,CD8和CD56 mRNA量穩(wěn)定,相應(yīng)的蛋白量亦穩(wěn)定。
　　 本文接著從分離得到的高活性、高純度的陷窩細(xì)胞入手,用含11789個(gè)已知基因、13231個(gè)未知基因的Rat Genome2302.0芯片首次檢測(cè)大鼠2/3肝切除后

4、恢復(fù)10個(gè)時(shí)點(diǎn)的肝陷窩細(xì)胞基因表達(dá)譜,用real-time PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性,用生物信息學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)方法分析它們與大鼠肝再生的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),共970個(gè)基因(包括612個(gè)已知基因和358個(gè)未知基因)與大鼠肝再生相關(guān)。聚類分析顯示上述612個(gè)已知基因明顯呈現(xiàn)上調(diào)和下調(diào)兩種表達(dá)模式,k-means按照它們?cè)诟卧偕械谋磉_(dá)異同細(xì)分為Cluster1-8。GO分析顯示上調(diào)基因和下調(diào)基因均主要涉及23種生理活動(dòng)。根據(jù)大鼠再生肝陷窩細(xì)

5、胞的基因表達(dá)模式和功能富集分析,發(fā)現(xiàn)陷窩細(xì)胞中的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等活性物質(zhì)的分泌及其參與的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)在肝再生啟動(dòng)階段增強(qiáng),肝陷窩細(xì)胞增殖主要在24-72h之間,免疫、炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄及效應(yīng)發(fā)揮主要發(fā)生在肝再生終止階段,而陷窩細(xì)胞顯然不承擔(dān)創(chuàng)傷愈合和基礎(chǔ)物質(zhì)代謝的功能角色。
　　 其中,骨橋蛋白(osteopontin,OPN)是一種活化淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的活性細(xì)胞因子,它的mRNA水平在2-72h再生肝陷窩細(xì)胞中顯著上

6、調(diào),最高達(dá)是對(duì)照的31倍。應(yīng)用Pathway Studio7.0分析、建立陷窩細(xì)胞中肝再生相關(guān)基因之間的互作關(guān)系網(wǎng)發(fā)現(xiàn),與OPN有關(guān)聯(lián)的蛋白多達(dá)30多個(gè),包括調(diào)節(jié)蛋白和靶蛋白,多種炎性疾病的發(fā)生與此基因互作網(wǎng)相關(guān)。說(shuō)明OPN與再生肝的陷窩細(xì)胞密切相關(guān)。
　　 為闡明OPN對(duì)肝再生的影響,本研究克隆了opn基因,并構(gòu)建了opn的表達(dá)載體pEGFP-N1-opn及其干涉載體pGenesil-1.0-opn(313)和pGenesil

7、-1.0-opn(887),在此基礎(chǔ)上繼續(xù)構(gòu)建了干涉載體對(duì)應(yīng)的檢驗(yàn)載體pGenesil-1.0-HK.-opn、pGenesil-1.0-opn(313)-opn和pGenesil-1.0-opn(887)-opn。將各檢驗(yàn)載體分別進(jìn)行液壓轉(zhuǎn)基因,根據(jù)與OPN融合表達(dá)的綠色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率與對(duì)照相比的下降程度,判斷pGenesil-1.0-opn(313)比pGenesil-1.0-opn(887)的干涉效果強(qiáng)烈。將表達(dá)載體和干涉載體

8、分別進(jìn)行液壓轉(zhuǎn)基因得出外源性基因或干涉片段的表達(dá)高峰時(shí)點(diǎn),結(jié)合內(nèi)源性opn在大鼠再生肝組織中PH后6-12h表達(dá)最高,依據(jù)使內(nèi)源性和外源性opn的作用疊加的原則,選擇于PH前30h轉(zhuǎn)入表達(dá)載體,PH后0h轉(zhuǎn)入干涉載體。通過(guò)對(duì)大鼠死亡率、表達(dá)動(dòng)力學(xué)、組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、再生肝指數(shù)、肝再生率等方面的結(jié)果分析表明:轉(zhuǎn)入opn表達(dá)載體后,炎癥反應(yīng)和肝損傷明顯加劇。相反,干涉質(zhì)粒pGenesil-1.0-opn(313)能顯著降低肝系數(shù)和肝再生率,減少