三角梅核糖體失活蛋白的基因克隆和表達研究.pdf

1、核糖體失活蛋白(ribosome-inactivatingprotein，RIP)，是一類具有抗病毒活性的蛋白，通過直接作用于核糖體來抑制蛋白質(zhì)的合成。RIP根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同可分為2種類型：Ⅰ型和Ⅱ型。Bouganin是從三角梅中分離出來的一種Ⅰ型核糖體失活蛋白，是目前所發(fā)現(xiàn)的毒性最低的一種RIP。 根據(jù)已報道的BouganincDNA序列，設(shè)計合成兩條引物，在兩條引物上分別添加NotⅠ酶切位點，TAA終止密碼子和XhoⅠ酶切位

2、點，從廈門本地的光葉三角梅基因組DNA里克隆出了一種新的核糖體失活蛋白基因。將獲得的Bouganin基因連接到pMD18-T載體后，進行了測序分析。結(jié)果表明長度為750bp，與已報道的Bouganin基因同源性為83％，但推導(dǎo)出的氨基酸序列里，第229氨基酸處出現(xiàn)了一個終止子。 pMD-18T-Bouganin用NotⅠ和XhoⅠ酶切后，與經(jīng)同樣酶切的pET28a質(zhì)粒連接，構(gòu)建了表達載體pET-28a-Bouganin。含重組

3、子pET-28a-Bouganin的大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，菌液及菌體超聲破菌后沉淀和上清12％SDS-PAGE電泳，經(jīng)誘導(dǎo)菌液泳道及超聲沉淀泳道均可見一分子量約為29kDa的蛋白條帶，與Bouganin的分子量吻合，而未誘導(dǎo)菌液與超聲上清無相應(yīng)條帶，這說明Bouganin以包含體形式正確表達。對誘導(dǎo)條件進行了摸索，在28℃下誘導(dǎo)6小時條件下Bouganin蛋白表達量最高。MTT法進行毒性檢測，檢測了重組Bouganin蛋白

4、對HepG2癌細(xì)胞的毒性作用，表明獲得的重組Bouganin蛋白具有一定的細(xì)胞毒性。 本研究從具有廈門特色的光葉三角梅(Bougainvilleaglabra)中的艷紫三角梅品種(Sanderiana)中，利用基因工程方法克隆具有自主知識產(chǎn)權(quán)的三角梅失活蛋白的基因，構(gòu)建其原核表達系統(tǒng)，并獲得有活性的蛋白質(zhì)。Bouganin基因的成功克隆和表達為Bouganin結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定了基礎(chǔ)，也為農(nóng)業(yè)抗病蟲害和醫(yī)學(xué)上抗腫瘤的應(yīng)用提供