麻瘋樹（Jatropha curcas）花藥培養(yǎng)及兩個(gè)核糖體失活蛋白基因的表達(dá)研究.pdf

1、pU川人學(xué)博lj學(xué)位論文暗培養(yǎng)條件下，1／2MSIAA01mg／L的培養(yǎng)基能誘導(dǎo)愈傷組織生根，但分化率很低，僅667％。2研究了不同激素組合和培養(yǎng)方式對(duì)花藥愈傷組織中PPO和POD活性的影響。結(jié)果表明，固體培養(yǎng)過程中，PPO和POD活性都出現(xiàn)2次活性高峰，一次在3d，一次在21d(添加N從的出現(xiàn)在24d)，分別與逆境和生長(zhǎng)旺盛期相關(guān)，懸浮培養(yǎng)出現(xiàn)1次，在12d，出現(xiàn)在生長(zhǎng)旺盛期；添加24D和NAA的培養(yǎng)基培養(yǎng)的愈傷組織中，PPO和POD

2、的活性要高于添加IBA和IAA的，添加KT的，活性要高于添加6BA的；光照造成培養(yǎng)方式對(duì)PPO活性的影響要大于對(duì)POD的影響；在早期PPO和POD的活性都出現(xiàn)高峰，隨時(shí)『日J(rèn)的推移，活性都會(huì)下降，PPO的下降趨勢(shì)遠(yuǎn)高于POD。3兩個(gè)原核表=i厶拽體的構(gòu)建：『1J根捌curcin2基因序列(GenBank奇錄號(hào)：AY435214)設(shè)計(jì)的擴(kuò)增成熟肽編碼區(qū)的特異性引物：P1：5’一GGATCC(BamHI)ATGGCTGGTTCCACTT7f

3、3’；P2：5GAGCTC(SacI)ATAcArTGGAAAGATGAGGA3’，以提取的麻瘋樹基因組D1qA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物并連接到pMDl8T載體，獲重組子pMD18T／curein2，轉(zhuǎn)化EcoliJMl09。經(jīng)測(cè)序以驗(yàn)證目的片段序列的正確性。用BamHI和SacI對(duì)重組質(zhì)粒pMD—18T／curcin和表達(dá)載體pET32(c)=pQE一30進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，得到帶互補(bǔ)粘性術(shù)端的curcin2基因片段

4、(約930bp)和pET32(c)、pQE30的線性表達(dá)載體。用T4DNA連接酶將所得的目的片斷分別與線形表達(dá)質(zhì)粒pET32(c)、pQE一30在1(℃下連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體pETC和pQEC。并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)的EcoliJMl09，經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定，證明目的片段curcin2正確插入表達(dá)載體，成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pETC和pQEC。。4兩種重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)：將含有重組子pETC、pQEC的EcoliJMl09轉(zhuǎn)

5、化菌于37℃下擴(kuò)大培養(yǎng)，并提耿質(zhì)粒。把重組質(zhì)粒pETC轉(zhuǎn)入感受態(tài)的EcoliBL21，重組質(zhì)粒pQE—C轉(zhuǎn)入感受態(tài)的EcoliM15。經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定，證明成功獲得轉(zhuǎn)化子PCB和PCM。用不同的誘導(dǎo)溫度，不同的誘導(dǎo)時(shí)間及不同的IPTG誘導(dǎo)濃度同時(shí)作用兩種重組菌PCB和PCM。經(jīng)SDSPAGE和Westernblotting檢測(cè)，結(jié)果表明，在任何誘導(dǎo)條件下，重組子PCB都沒有curcin2重組蛋白產(chǎn)生，而PCM都能表達(dá)出cu