荔枝古樹EC離體保存優(yōu)化及其SOD克隆與啟動(dòng)子功能驗(yàn)證.pdf

1、福州西禪寺的“宋荔”是最負(fù)盛名的荔枝古樹之一，也是西禪寺重要的景觀之一，具有很高的園林觀賞價(jià)值；同時(shí)，由于其歷經(jīng)千年，是一座優(yōu)良的荔枝“基因庫”。因此，本研究以荔枝古樹“宋荔”為材料，在前人的基礎(chǔ)上，進(jìn)行荔枝古樹胚性愈傷組織（embryogenic callus，EC）體胚發(fā)生和離體保存條件優(yōu)化；進(jìn)一步克隆荔枝古樹EC SOD家族基因成員，分離5‘側(cè)翼序列，并對所得5‘側(cè)翼序列進(jìn)行生物信息學(xué)順式元件分析和部分啟動(dòng)子的功能驗(yàn)證，為探討SO

2、D基因家族在荔枝古樹EC體胚發(fā)生和離體保存的分子機(jī)制，以便更全面地研究LcSODs在荔枝古樹原生境下應(yīng)對逆境脅迫的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為荔枝古樹保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。本研究主要結(jié)果如下：
　　1荔枝古樹EC體胚發(fā)生和離體保存優(yōu)化
　　1.1、荔枝古樹EC體胚發(fā)生條件的優(yōu)化
　　以“宋荔”的胚性愈傷組織（EC）為試驗(yàn)材料，采用不同濃度的KT、NAA、和ZT進(jìn)行正交試驗(yàn)，探討荔枝古樹EC體胚發(fā)生的優(yōu)化條件。結(jié)果表明：在常規(guī)離體

3、保存溫度25±2℃，采用MS+0.5 mg/L KT+0.1 mg/L NAA+3.0 mg/L ZT+50 g/L蔗糖+10 g/L瓊脂， pH5.8的培養(yǎng)基條件下暗培養(yǎng)35天可獲得高頻率的荔枝古樹EC的體胚。其中ZT促進(jìn)荔枝古樹EC的體胚發(fā)生影響最顯著，而KT影響不顯著，但適量的KT和NAA組合對荔枝古樹EC的體胚發(fā)生有一定的促進(jìn)作用。
　　1.2、荔枝古樹EC離體保存條件的優(yōu)化
　　以“宋荔”的胚性愈傷組織（EC）為試

4、驗(yàn)材料，采用不同濃度的PP333、肌醇和MS的大量元素進(jìn)行正交試驗(yàn)，探討荔枝古樹EC的限制生長保存條件。結(jié)果表明：在常規(guī)離體保存溫度25±2℃，采用3/4MS+10 mg/L PP333+300 mg/L肌醇+1.0 mg/L2.4-D+20 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，pH5.8的培養(yǎng)基條件下弱光培養(yǎng)保存100 d后，其胚性愈傷組織的生長量最高且同時(shí)還能維持較高的細(xì)胞活性。適量的PP333、肌醇和MS培養(yǎng)基中大量元素的含量對荔枝古樹E

5、C的限制生長保存都起一定的促進(jìn)作用。
　　2、荔枝古樹EC SOD基因家族其它成員cDNA和DNA克隆及生物信息學(xué)分析
　　以“宋荔”的胚性愈傷組織（EC）為試驗(yàn)材料，在前人的基礎(chǔ)上，采用RT-PCR和RACE法又成功獲得了3個(gè)成員類型的8個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄本（包含可變剪接），完善了荔枝古樹EC SOD家族成員的克隆。分別為 LcFe-SOD7a（KC492109）、LcFe-SOD7b（KC492110）、LcCu/Zn-SO

6、D3（KF574007）、LcCu/Zn-SOD3a（KF574008）、LcCu/Zn-SOD3b（KF574009）、LcCu/Zn-SOD3c（KF574010）、LcCu/Zn-SOD4（KJ577742）和LcCu/Zn-SOD4-1（KJ577743）。其中LcFe-SOD7類型的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本屬可變剪接現(xiàn)象，LcFe-SOD7b相對LcFe-SOD7a插入了完整的第5個(gè)內(nèi)含子，分別編碼不同的蛋白質(zhì)；LcCu/Zn-SOD4類型

7、的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本也屬可變剪接現(xiàn)象，編碼相同的蛋白質(zhì)。而LcCu/Zn-SOD3類型的4個(gè)轉(zhuǎn)錄本屬于3‘端的聚腺苷酸化現(xiàn)象，編碼相同的蛋白質(zhì)。
　　此外，試驗(yàn)還獲得荔枝古樹SOD基因家族中5個(gè)成員相應(yīng)的基因組DNA序列，分別為LcFe-SOD1（JX878357）基因組全長為929 bp，由4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子組成；LcFe-SOD7（KC492127）基因組gDNA長2284 bp，由7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子組成；LcCu/Zn-SO

8、D4（JX911315）基因組gDNA長1822 bp，由6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子組成；LcCu/Zn-SOD3（KF672186）基因組gDNA長為4196 bp，由6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子組成； LcMn-SOD（JX880085）基因組gDNA長1620 bp，由5個(gè)內(nèi)含子和6個(gè)外顯子組成。分析發(fā)現(xiàn)荔枝古樹LcSODs不同成員之間內(nèi)含子和外顯子數(shù)量相對均勻，處于4-8之間，且大部分成員中都含有一個(gè)相對較長的內(nèi)含子。
　　生物信息

9、學(xué)分析表明：試驗(yàn)所得的荔枝古樹SOD基因家族LcFe-SOD7a、LcFe-SOD7b、LcCu/Zn-SOD3和LcCu/Zn-SOD4編碼的四種蛋白均屬親水、穩(wěn)定蛋白，在一定程度功能相似又各有分工，其中同一類型蛋白之間更具保守性。其中LcFe-SOD7a和LcFe-SOD7b兩個(gè)蛋白僅在末端上存在差異，均由α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲組成；定位相同，主要定位在微體（過氧化物酶體）和細(xì)胞質(zhì)中；傾向于N末端朝外的由外到內(nèi)進(jìn)行跨膜運(yùn)動(dòng)；并存

10、在以酪氨酸為主，絲氨酸和蘇氨酸為輔的磷酸化修飾。而LcCu/Zn-SOD3和LcCu/Zn-SOD4兩個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)也高度相似，主要由β折疊和無規(guī)則卷曲組成，均不含有螺旋結(jié)構(gòu)；也均主要定位在細(xì)胞質(zhì)；且都不存在跨膜結(jié)構(gòu)和有酪氨酸位點(diǎn)，并進(jìn)行以絲氨酸為主、蘇氨酸為輔的位點(diǎn)磷酸化修飾。
　　3、荔枝古樹EC SOD基因家族成員啟動(dòng)子克隆及元件分析
　　為進(jìn)一步了解荔枝古樹EC SOD基因家族的調(diào)控影響因子，本研究采用Tail-PCR結(jié)

11、合接頭酶切法分離LcSODs基因家族不同成員的5’調(diào)控序列。分別獲得LcFe-SOD1（JX878357）5’調(diào)控序列長為1126 bp；LcFe-SOD7（KC492127.2）5’調(diào)控序列長為865 bp；LcCu/Zn-SOD4的5’調(diào)控序列長為1447 bp；LcCu/Zn-SOD3（KF672186.1）5’調(diào)控序列長為1426 bp；LcMn-SOD（JX880085.2）5’調(diào)控序列長為2091 bp。其中LcFe-SOD

12、1和LcCu/Zn-SOD4的5‘UTR中均含有內(nèi)含子序列。PlantCare結(jié)合PLACE在線軟件元件預(yù)測顯示荔枝古樹EC SOD基因家族的5’調(diào)控序列中除了均含有大量的TATA-box和CAAT-box核心元件外，還存在大量的光響應(yīng)元件、激素應(yīng)答元件、逆境應(yīng)答元件、胚乳表達(dá)元件、細(xì)胞周期響應(yīng)元件和大量的功能未知或功能特異元件。此外，荔枝古樹LcSODs可能均受到不同程度的WRKY類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控；LcCu/Zn-SOD3、LcCu/

13、Zn-SOD4、LcFe-SOD7和LcMn-SOD基因可能還受MYB類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控；而 LcCu/Zn-SOD4、LcFe-SOD1和LcMn-SOD基因可能還受bZIP類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。
　　4、荔枝古樹EC SOD基因家族部分啟動(dòng)子功能驗(yàn)證
　　為進(jìn)一步分析克隆所獲得的荔枝古樹SOD基因家族的啟動(dòng)子功能，通過轉(zhuǎn)化擬南芥分析表明：克隆所獲得的LcCu/Zn-SOD3、LcFe-SOD7和不含內(nèi)含子的LcCu/Zn-SOD

14、4基因的5‘端啟動(dòng)子（均帶有部分第一外顯子序列）均可以驅(qū)動(dòng)下游基因表達(dá)活性；且三條啟動(dòng)子在擬南芥植株的根、莖、葉中均有表達(dá)，表明LcCu/Zn-SOD3、LcCu/Zn-SOD4和LcFe-SOD7三條啟動(dòng)子均為組成型啟動(dòng)子。且不同脅迫處理表明，LcCu/Zn-SOD3、LcCu/Zn-SOD4和LcFe-SOD7三個(gè)成員的啟動(dòng)子均能不同程度的響應(yīng)NaCl、PEG-6000、ABA、MeJA和損傷脅迫。
　　5、荔枝古樹5'UTR

15、中的內(nèi)含子對LcCSD4啟動(dòng)子功能活性影響分析
　　分析發(fā)現(xiàn)在荔枝古樹LcCu/Zn-SOD4基因組的5‘UTR中存在兩個(gè)較長的內(nèi)含子序列。為探討該內(nèi)含子對LcCu/Zn-SOD4基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)活性的影響，本章構(gòu)建了克隆獲得的5‘側(cè)翼全部序列驅(qū)動(dòng)GUS基因的植物表達(dá)載體并進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)和轉(zhuǎn)化煙草永久表達(dá)分析。研究結(jié)果表明：在轉(zhuǎn)錄水平上，所得的陽性植株中該內(nèi)含子并未被剪切，而是連接GUS序列一起作為下游基因序列參與轉(zhuǎn)錄；在翻譯水平上，