福州市荔枝古樹遺傳多樣性的RAPD分析及離體保存研究.pdf

1、荔枝(Litchi chinensis)在我國栽培歷史至少有2000多年，是我國南方特色的熱帶珍貴果樹之一；同時(shí)，在我國南方，荔枝還是重要的熱帶南亞熱帶風(fēng)光代表性的風(fēng)景樹，在城市園林綠化和風(fēng)景區(qū)得到廣泛應(yīng)用。古樹、名木在園林景觀中往往是一道無與倫比的風(fēng)景線，是歷代陵園、名勝古跡的佳景之一，也是一個(gè)城市重要的自然和人文景觀；古樹的基因圖譜往往有其特殊性，具有長(zhǎng)壽基因和抗性基因以及其他有價(jià)值的基因，是植物遺傳改良的最寶貴的種質(zhì)材料。福州市荔

2、枝古樹資源豐富，在荔枝史上的占重要地位。鑒于此，我們首先采用RAPD分子標(biāo)記對(duì)福州市荔枝古樹資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，進(jìn)一步對(duì)福州市荔枝古樹的核心種質(zhì)進(jìn)行離體限制生長(zhǎng)保存研究，并采用分子生物學(xué)和蛋白組學(xué)手段對(duì)荔枝古樹離體保存機(jī)理進(jìn)行研究。主要研究結(jié)果如下： 1.福州市荔枝古樹遺傳多樣性的RAPD分析 本試驗(yàn)采用RAPD技術(shù)對(duì)福州市66份荔枝古樹資源(含2份據(jù)傳說是福州西湖“十八娘”古荔枝后代的資源)進(jìn)行了遺傳多樣性分析。研

3、究結(jié)果表明：16個(gè)隨機(jī)引物共產(chǎn)生232條RAPD帶，其中216條為多態(tài)性帶，占總帶數(shù)的93.10％，表明66份荔枝古樹資源有豐富的多樣性。根據(jù)擴(kuò)增條帶多態(tài)性，利用UPGMA構(gòu)建了荔枝古樹的親緣關(guān)系樹狀圖，遺傳距離為0.000-1.000。當(dāng)D=0.909時(shí)，66份荔枝古樹資源可以分為3組；當(dāng)D=0.746時(shí)，分為9組：當(dāng)D=0.578時(shí)，可歸為18組，福州市區(qū)荔枝古樹可分為17組，另1組為2份據(jù)傳說是福州西湖十八娘古荔枝后代的資源。同一

4、地方的荔枝古樹基本可以劃分在一起，但也有個(gè)別劃分在不同組，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說明福州市區(qū)荔枝古樹群體存在一定的遺傳變異。根據(jù)荔枝古樹RAPD條帶的代表性，結(jié)合考慮樹齡和知名度等因素，初步確定17個(gè)荔枝古樹為福州市荔枝古樹的核心種質(zhì)。 2.福州市荔枝古樹種質(zhì)資源的離體限制生長(zhǎng)保存及體胚發(fā)生 通過花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)得到了17個(gè)荔枝古樹核心種質(zhì)的胚性愈傷組織(emberyogenic callus，EC)，并確定最佳離體保存方案為：接種

5、量每瓶50 mg，分為3團(tuán)接種于附加2，4-D1.0 mg·L-1、甘露醇2％、蔗糖20 g·L-1、瓊脂8g·L-1的MS培養(yǎng)基上，在20℃，pH5.8，暗培養(yǎng)，可以將荔枝古樹EC的繼代周期延長(zhǎng)至125 d。保存后的荔枝古樹EC有強(qiáng)烈的體胚發(fā)生能力及植株再生能力。遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行RAPD檢測(cè)表明：限制生長(zhǎng)保存后荔枝古樹EC的變異率為7.70％。 3.福州市荔枝古樹EC的GPX活性研究及其基因的克隆 以常規(guī)繼代保存和最佳離

6、體保存的荔枝古樹EC為材料，進(jìn)行了保存過程中GPX活性變化的研究。結(jié)果表明：最佳離體保存和常規(guī)繼代保存下，荔枝古樹愈傷組織保存過程中的GPX活性呈規(guī)律表達(dá)，均出現(xiàn)兩個(gè)高峰值，說明荔枝古樹EC的GPX與維持荔枝古樹胚性愈傷組織的離體保存密切相關(guān)。第一個(gè)GPX酶活性最高值的出現(xiàn)與胚性愈傷組織大量增殖有關(guān)，是生長(zhǎng)高峰即將到來的標(biāo)志。第2個(gè)GPX酶活性最高值的出現(xiàn)是愈傷組織進(jìn)入衰老期的象征。但在最佳保存方案下，荔枝古樹胚性愈傷組織的兩個(gè)GPX高

7、峰期的出現(xiàn)要分別比對(duì)照(常規(guī)繼代保存)下遲得多。 從西禪寺“宋荔”花藥EC克隆獲得抗性基因GPX的cDNA和DNA全長(zhǎng)。其cDNA開放閱讀框大小是507 bp(登錄號(hào)：FJ172343)：其DNA全長(zhǎng)大小是1809 bp(登錄號(hào)：FJ465145)，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。同時(shí)，應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析了GPX基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、親疏水特性、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)功能域、信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)、模序(Moti

8、f)分析、亞細(xì)胞定位、分子進(jìn)化等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。 4.福州市荔枝古樹胚性愈傷組織離體保存過程中蛋白組學(xué)研究 采用固相pH梯度凝膠雙向電泳技術(shù)和生物質(zhì)譜(肽質(zhì)量指紋譜PMF和串聯(lián)質(zhì)譜)技術(shù)對(duì)常規(guī)繼代保存過程(15 d、20 d、30 d)中的荔枝古樹胚性愈傷組織進(jìn)行蛋白組學(xué)研究，并以常規(guī)繼代保存30 d的EC和最佳離體保存方案下30 d的EC進(jìn)行差異蛋白組學(xué)研究。 (1)荔枝古樹EC離體保存過程中蛋白組分、MW和pI

9、變化 荔枝古樹EC在常規(guī)保存過程(15 d、20 d、30 d)和最佳保存方案保存(30 d)中的蛋白組分、MW和pI變化為：①隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，蛋白點(diǎn)數(shù)目變化是先下降后上升趨勢(shì)，分別為1311、1256、1441個(gè)；在最佳保存方案的蛋白點(diǎn)數(shù)目少于常規(guī)保存的蛋白點(diǎn)數(shù)目，僅為1023個(gè)，表明在快速生長(zhǎng)和接近衰老時(shí)期蛋白質(zhì)合成活躍，而在最佳保存方案則蛋白合成相對(duì)較少，處于“休眠”狀態(tài)。②隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，小分子量(<15KD)蛋

10、白所占比例呈逐漸減少趨勢(shì)；在最佳保存方案小分子量蛋白占總蛋白比例明顯增加，推測(cè)可能小分子量蛋白多是維持胚性愈傷組織正常生長(zhǎng)的蛋白。⑨隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，pI在4-5之間的蛋白質(zhì)比例逐漸增加，pI在5-6之間的蛋白質(zhì)變化幅度較小，pI在6-7之間的蛋白質(zhì)比例逐漸降低；在最佳保存方案下pI在5-7之間的蛋白點(diǎn)比例增大，特別是pI5-6增加最為明顯，pI在4-5之間的蛋白點(diǎn)比例較小，推測(cè)維持胚性愈傷組織正常分裂增殖的蛋白pI多集中在5-7之間

11、，衰老或抗衰老氧化蛋白的pI多集中在4-5之間。 (2)荔枝古樹EC離體保存過程中相關(guān)蛋白的質(zhì)譜鑒定及其功能分析 采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)或肽指紋-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)方法對(duì)雙向電泳分離得到離體保存相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定，成功鑒定39個(gè)蛋白(p<0.05)。鑒定的蛋白可以分為八個(gè)功能類群，即氨基酸代謝(1個(gè)蛋白)、脂類代謝(2個(gè)蛋白)、核酸代謝(2個(gè)蛋白)、蛋白代謝與修復(fù)(15個(gè)蛋白)、細(xì)胞組成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(2個(gè)蛋白)、能量和碳代謝(4

12、個(gè)蛋白)、脅迫反應(yīng)與氧化還原(8個(gè)蛋白)及功能未知蛋白(5個(gè)蛋白)等。 成功鑒定蛋白的功能分析表明：荔枝古樹EC在常規(guī)保存過程中能量和碳代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)呈先降低再升高趨勢(shì)；信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白、脂類代謝相關(guān)蛋白、氨基酸代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)呈逐漸下降表達(dá)趨勢(shì)；脅迫反應(yīng)/氧化還原相關(guān)蛋白、細(xì)胞組成相關(guān)蛋白、核酸代謝相關(guān)蛋白、蛋白質(zhì)代謝與修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)呈穩(wěn)定表達(dá)狀態(tài)。 荔枝古樹EC繼代30 d時(shí)，脅迫反應(yīng)/氧化還原相關(guān)蛋白、核