人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶CTL表位多抗原肽(MAP)疫苗的設(shè)計(jì)及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、[背景和目的]
　　 惡性腫瘤是危害人類健康的主要疾病之一，傳統(tǒng)的手術(shù)、放、化療的療效又不盡人意，這種局限決定了生物治療必然要參與腫瘤的綜合治療，而腫瘤疫苗是腫瘤生物治療的重要方法。目前常用的腫瘤疫苗傳遞方式分別以細(xì)胞、蛋白質(zhì)、多肽、病毒載體為基礎(chǔ)。樹(shù)突細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)是目前已知的抗原提呈功能最強(qiáng)的免疫細(xì)胞，將腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-asscociated antigen，TAA)負(fù)載DC是目前常

2、用的腫瘤免疫治療的方式之一。但目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原大多具有組織特異性，如AFP只針對(duì)肝癌等，以這些抗原來(lái)進(jìn)行免疫治療，只能對(duì)相應(yīng)的腫瘤起作用，限制了以這些抗原為靶標(biāo)的腫瘤疫苗的廣泛應(yīng)用。尋找腫瘤特異性的共有抗原是腫瘤免疫治療的關(guān)鍵問(wèn)題。
　　 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶，又名人端粒酶催化亞單位，為端粒酶活性的限速成分，是癌細(xì)胞永生化的必要途徑，在維持腫瘤繼續(xù)分裂、增殖和生存中發(fā)揮重要作用。國(guó)內(nèi)外許多研究表明，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在85%以上

3、的惡性腫瘤及其癌前病變中過(guò)度表達(dá)，其異常表達(dá)或激活是腫瘤形成的重要原因之一，新近研究報(bào)道人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的高表達(dá)也與腫瘤的不良預(yù)后、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)。我們過(guò)去的研究表明，帶有hTERT全長(zhǎng)基因的腺病毒載體負(fù)載DC，以及帶有hTERT全長(zhǎng)基因和隱性表位的顆粒疫苗，在體內(nèi)外均可以誘導(dǎo)產(chǎn)生hTERT特異性的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTLs)，對(duì)hTERT陽(yáng)性的胃癌、結(jié)腸癌等多種癌細(xì)胞具有一定的殺傷效應(yīng)，而對(duì)表達(dá)hTERT陰性的淋巴細(xì)胞和DC不具有

4、殺傷效應(yīng)。與hTERT全基因序列腺病毒負(fù)載DC疫苗相比，多肽疫苗沒(méi)有腺病毒載體的參與，不必考慮載體及其整合的安全性，也不必考慮全長(zhǎng)蛋白中某些非優(yōu)勢(shì)表位或病理表位的毒副作用；而且，抗原肽長(zhǎng)度僅8-15個(gè)左右的氨基酸序列，體外可以合成，臨床應(yīng)用前景更廣闊。但多肽疫苗也常有其不足之處：最大的問(wèn)題在于一個(gè)多肽疫苗只能代表一個(gè)表位，分子量小，結(jié)構(gòu)單一，免疫原性較弱，在體內(nèi)容易降解。為解決這一弊端，1988年Tam實(shí)驗(yàn)室提出了多抗原肽(Multip

5、le antigen peptides，MAP)的設(shè)計(jì)方案，其聚賴氨酸核心構(gòu)成一種十分緊密有序的樹(shù)狀結(jié)構(gòu)，它在加強(qiáng)了抗原表位肽鏈結(jié)構(gòu)特異性的同時(shí)，還增大其分子質(zhì)量，不僅很好的模擬了天然表位的空間構(gòu)象，而且還不需要再耦聯(lián)載體蛋白就能誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)；同時(shí)，其穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)不易反轉(zhuǎn)，故降解速度減緩，延長(zhǎng)抗原刺激時(shí)間，獲得更好的殺傷活性。MAP疫苗的設(shè)計(jì)方案不僅適用于B細(xì)胞表位，同樣也適用于T細(xì)胞表位。
　　 基于以上分析，本實(shí)驗(yàn)擬

6、選取人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶HLA-A2限制性CTL表位hTERT-540(ILAKFLHWL)，hTERT-865(RLVDDFLLV)and hTERT-572Y(YLFFYRKSV)，構(gòu)建其四分支多抗原肽，研究其在體外體內(nèi)的抗腫瘤活性，并與攜帶hTERT全長(zhǎng)基因腺病毒載體疫苗、單肽疫苗誘導(dǎo)的CTL活性進(jìn)行對(duì)比，為hTERT的MAP疫苗抗腫瘤效應(yīng)的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 [方法]
　　 1、選取三條人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶CT

7、L表位[hTERT-540(ILAKFLHWL)，hTERT-865(RLVDDFLLV)and hTERT-572Y(YLFFYRKSV)]設(shè)計(jì)其MAP結(jié)構(gòu)，采用標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成法(SPSS)合成其四分支肽；反相高壓液相色譜儀(RP-HPLC)
　　 分析其純度；液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS)檢測(cè)多肽分子量。陰性肽選用人HIV病毒HLA-A2限制性表位(ILLEP VHGV)。
　　 2、按文獻(xiàn)所述分離培養(yǎng)人外周血單個(gè)

8、核細(xì)胞(PBMC)來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞。采用光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)，并采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定其細(xì)胞表型。然后將攜帶hTERT全長(zhǎng)序列的腺病毒載體、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶MAP肽、及其對(duì)應(yīng)單肽分別負(fù)載DC后，誘導(dǎo)產(chǎn)生人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶特異性CTL。采用標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶特異性CTL對(duì)不同腫瘤靶細(xì)胞[SW480結(jié)腸癌細(xì)胞(hTERT+，HLA-A2+)、KATO-Ⅲ胃癌細(xì)胞(hTERT+，HLA-A2+)、U2OS骨肉瘤細(xì)胞(hTERT-

9、，HLA-A2+)，轉(zhuǎn)染了人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA的U2OS/hTERT骨肉瘤細(xì)胞(hTERT+，HLA-A2+)，MCF-7乳腺癌細(xì)胞(hTERT+，HLA-A2+)，HepG2肝癌細(xì)胞(hTERT+，HLA-A2-)，轉(zhuǎn)染了HLA-A2 cDNA的HepG2/HLA-A2肝癌細(xì)胞(hTERT+，HLA-A2+)的免疫殺傷活性；采取同樣方法檢測(cè)上述人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶特異性CTL對(duì)低表達(dá)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的自體淋巴細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞有無(wú)殺傷作用

10、以研究其毒副作用；采用ELISPOT試驗(yàn)檢測(cè)產(chǎn)IFN-γ效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量。
　　 3、按文獻(xiàn)所述分離培養(yǎng)C57BL/6-Tg(HLA-A2+)小鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞(mDC)，
　　 采用光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)，采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定其細(xì)胞表型。然后將攜帶hTERT全長(zhǎng)序列的腺病毒載體、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶MAP肽、及其對(duì)應(yīng)單肽分別負(fù)載mDC后，免疫小鼠，每周一次，共三次。最后一次免疫7天后取免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，51Cr

11、釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶特異性CTL對(duì)上述的腫瘤靶細(xì)胞以及自體淋巴細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞有無(wú)殺傷效應(yīng)；采用ELISPOT試驗(yàn)檢測(cè)產(chǎn)IFN-γ效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量。
　　 4、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 1、通過(guò)反相高壓液相色譜儀(RP-HPLC)檢測(cè)合成的多抗原肽及對(duì)應(yīng)單肽的純度均在95%以上，達(dá)到國(guó)際多肽實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC

12、/MS)檢測(cè)合成的多抗原肽及對(duì)應(yīng)單肽的分子量，結(jié)果表明所得肽的分子量理論值與實(shí)測(cè)值之間無(wú)明顯差異，為我們所需的目的多肽。
　　 2、體外(In vitro)和離體(Ex vivo)實(shí)驗(yàn)均提示，攜帶全長(zhǎng)hTERT序列的腺病毒載體、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶特異性CTL對(duì)于人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶陽(yáng)性且HLA-A2陽(yáng)性的SW480、MCF-7、KATO-Ⅲ細(xì)胞具有明顯的殺傷作用，且攜帶全長(zhǎng)hTERT序列的腺病毒載體誘導(dǎo)的殺傷效應(yīng)最強(qiáng)；人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶

13、MAP所誘導(dǎo)的殺傷效應(yīng)明顯高于其對(duì)應(yīng)單肽誘導(dǎo)的殺傷效應(yīng)；但對(duì)HLA-A2陽(yáng)性但人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶陰性的U2OS細(xì)胞或人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶陽(yáng)性但HLA-A2陰性的HepG2細(xì)胞均無(wú)殺傷效應(yīng)，對(duì)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶陽(yáng)性且HLA-A2.1匹配的U2OS/hTERT細(xì)胞和HepG2/HLA-A2.1細(xì)胞，提示該CTL反應(yīng)具有人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶特異性及HLA-A2限制性。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶MAP肽誘導(dǎo)的CTL，還是其對(duì)應(yīng)單肽誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)

14、胞對(duì)低表達(dá)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的自體淋巴細(xì)胞和DC都不具有殺傷效應(yīng)，提示人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶MAP肽疫苗的安全性。通過(guò)ELISPOT試驗(yàn)檢測(cè)產(chǎn)IFN-γ效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果顯示攜帶全長(zhǎng)hTERT序列的腺病毒載體可以誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞釋放最多IFN-γ；人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶MAP肽較之其對(duì)應(yīng)單肽可以誘導(dǎo)更多的效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。但在去除CD4+T淋巴細(xì)胞后，攜帶全長(zhǎng)hTERT序列的腺病毒載體、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶MAP肽及其對(duì)應(yīng)單肽誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞分泌IFN-