肝素酶HLA-A2限制性CTL表位肽的篩選及其活性鑒定.pdf

1、目的: 通過對(duì)計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測的肝素酶HLA-A2限制性CTL候選表位進(jìn)行HLA-A2親和力、體外殺傷腫瘤細(xì)胞等免疫學(xué)的研究，希望能夠發(fā)現(xiàn)肝素酶HLA-A2限制性CTL優(yōu)勢表位，為臨床腫瘤多肽疫苗的免疫治療提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1.采用SYFPEITHI和BIMAS軟件預(yù)測方法，對(duì)肝素酶HLA-A2限制性CTL表位進(jìn)行預(yù)測，合成候選表位肽； 2.利用T2細(xì)胞特點(diǎn)，對(duì)合成的候選肽與HLA-A2分子進(jìn)行

2、親和力分析； 3.利用乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗(yàn)檢測待檢肽特異性CTLs誘導(dǎo)活性： 4.利用ELISPOT試驗(yàn)檢測T細(xì)胞活性。 結(jié)果: 1.由SYFPEITHI和BIMAS預(yù)測軟件預(yù)測出HLA-A2陽性的九肽候選表位6個(gè)，其序列分別為：Hpa184-192(LIFGLNALL)、Hpa310-318(FLNPDVLDI)、Hpa315-323(VLDIFISSV)、Hpa363-371(FMWLDKLG

3、L)、Hpa405-413(WLSLLFKKL)和Hpa487-495(GLLSKSVQL)。 2.候選肽親和力實(shí)驗(yàn)通過多肽與T2細(xì)胞的結(jié)合情況來進(jìn)行驗(yàn)證，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，結(jié)果以熒光系數(shù)florescence index(FI)作為衡量指標(biāo)。結(jié)果顯示Hpa310-318(FLNPDVLDI)、Hpa315-323(VLDIFISSV)的熒光指數(shù)均>1.5，Hpa184-192(LIFGLNALL)、Hpa363-371(FM

4、WLDKLGL)的熒光指數(shù)處于1.0和1.5之間，Hpa405-413(WLSLLFKKL)和 Hpa487-495(GLLSKSVQL)熒光指數(shù)均<1.0。 3.LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：以候選表位肽刺激HLA-A2分子陽性健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells PBMCs)為效應(yīng)細(xì)胞、同時(shí)表達(dá)肝素酶和HLA-A2的人體HCC-LM6肝癌細(xì)胞和SW-480結(jié)腸癌細(xì)胞為靶細(xì)胞，效：

5、靶為40：1時(shí)Hpa310-318(FLNPDVLDI)刺激效應(yīng)細(xì)胞對(duì)HCC-LM6肝癌細(xì)胞的溶破率為52.48％，對(duì)SW-480結(jié)腸癌細(xì)胞的溶破率為44.17％，而其他各條候選肽沒有明顯的特異性溶破率。經(jīng)雙因素方差分析Hpa310-318(FLNPDVLDI)與其他各候選肽組間差異顯著(P<0.05)。 4.ELISPOT試驗(yàn)表明Hpa310-318(FLNPDVLDI)刺激PBMC產(chǎn)生的特異性分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)最多，空白

6、對(duì)照組最少。經(jīng)單因素方差分析Hpa310-318(FLNPDVLDI)與各組間差異均顯著(P<0.05)。 結(jié)論: 采用SYFPEITHI和BIMAS預(yù)測軟件對(duì)人類腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性抗原肝素酶(Hpa)的HLA-A2限制性CTL表位進(jìn)行預(yù)測，篩選出6個(gè)九肽候選表位。其中，Hpa310-318(FLNPDVLDI)與HLA-A2分子具有高親和力，在體外可有效誘導(dǎo)肝素酶特異性CTLs的產(chǎn)生，對(duì)肝素酶陽性且HLA-A2限制性的HC