乙型肝炎病毒HLA-A2限制性env-183-191表位變異對(duì)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的識(shí)別和免疫應(yīng)答的影響.pdf

1、背景: HBV感染是我國(guó)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。HBV感染就臨床表現(xiàn)而言形式多樣,可出現(xiàn)急性肝炎、慢性肝炎、肝臟纖維化、肝硬化及肝細(xì)胞癌等。部分感染患者可在慢性肝炎基礎(chǔ)上出現(xiàn)急性發(fā)作,導(dǎo)致肝功能衰竭,即慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF),死亡率高。作為機(jī)體清除或控制肝細(xì)胞內(nèi)HBV感染的重要免疫細(xì)胞——HBV抗原表位特異性CTL,它可識(shí)別HBV蛋白中的CTL表位(epitope),進(jìn)而發(fā)

2、揮其免疫作用。本研究在對(duì)不同基因型的急性乙型肝炎(acute hepatitis B,AHB)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)和ACLF患者的HBV HLA-A2限制性特異性CTL表位變異分析的基礎(chǔ)上,針對(duì)與疾病進(jìn)展相關(guān)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變異表位進(jìn)行體外HLA-A2分子親和力鑒定并對(duì) HBV包膜蛋白(envelop protein)上的HLA-A2限制性表位env183-191野生/變異多肽在HLA-A2轉(zhuǎn)基

3、因C57小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出的 CTL細(xì)胞對(duì)野生表位的識(shí)別和體外殺傷能力進(jìn)行研究,為進(jìn)一步分析研究HBV感染患者重癥化機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　目的:1.在獲得的不同診斷的乙型肝炎患者來(lái)源的HBV全長(zhǎng)序列,對(duì)比分析其已鑒定的HBV HLA-A2限制性表位的變異形式和變異后親和力的變化,確定與疾病進(jìn)程相關(guān)的表位變異類型。2.由于HLA-A2限制性表位env:183-191表位變異率在AHB和ACLF中較高,而CHB中較低,推測(cè)可能與宿主炎癥反

4、應(yīng)有關(guān),因此選擇其作為研究對(duì)象,明確其野生表位和變異表位在HLA-A2轉(zhuǎn)基因C57小鼠中的特異性CTL免疫識(shí)別和殺傷效應(yīng)。
　　方法:1.“兩片段”法PCR擴(kuò)增獲得不同診斷的乙型肝炎患者血清HBV全長(zhǎng)序列516條,對(duì)來(lái)源于HLA-A2陽(yáng)性患者的C基因型HBV全長(zhǎng)序列分析發(fā)現(xiàn)有12個(gè)表位的變異與乙肝疾病進(jìn)程相關(guān),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)已發(fā)現(xiàn)的12個(gè)存在變異的表位在BIMAS網(wǎng)站進(jìn)行親和力預(yù)測(cè),隨后采用人抗原呈遞相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷型淋巴細(xì)胞系

5、(T2)對(duì)env:183-191野生/變異表位進(jìn)行體外親和力實(shí)驗(yàn)。2.挑選HLA-A2限制性表位env:183-191(野生型WT:FLLTRILTI)和其對(duì)應(yīng)變異表位(S: FSLTRILTI;K:FLLTKILTI; SK:FSLTKILTI)構(gòu)建HBV env蛋白pcDNA-3.1(+)真核表達(dá)載體,免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因C57小鼠同時(shí)用相應(yīng)的表位多肽加強(qiáng)免疫5周后取小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行ELISOPT、HLA-A2/五聚體(Pent

6、amer)和體外細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:1.BIMAS親和力預(yù)測(cè)顯示有10個(gè)表位變異后與HLA-A2分子的親和力減弱,2個(gè)表位變異后親和力增強(qiáng)。T2細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)env:183-191野生型和變異型表位親和力結(jié)果與BIMAS預(yù)測(cè)結(jié)果一致。2.env:183-191野生/變異表位免疫小鼠后,ELISOPT實(shí)驗(yàn)顯示,WT有較強(qiáng)的IFN-γ分泌能力,K,S和SK能力較弱。Pentamer細(xì)胞染色流式分析后顯示K變異表位疫苗免疫小鼠對(duì)

7、野生表位CTL有交叉反應(yīng),但對(duì)S變異表位無(wú)交叉反應(yīng);S變異表位疫苗免疫小鼠對(duì)野生表位CTL有交叉反應(yīng),但對(duì)K變異表位無(wú)交叉反應(yīng)。SK變異表位疫苗免疫小鼠對(duì)野生表位和S變異表位有交叉反應(yīng),但對(duì)K變異表位無(wú)交叉反應(yīng);野生表位疫苗免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生較弱的針對(duì)K與S變異表位的交叉反應(yīng)。殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果與ELISPOT結(jié)果一致。WT免疫小鼠中特異性CTL的殺傷結(jié)果要明顯高于其他變異型表位多肽免疫小鼠中的。結(jié)果顯示變異型表位可誘導(dǎo)較野生型表位弱的CTL