精喹禾靈多克隆抗體的制備及其應(yīng)用研究.pdf

1、免疫學(xué)檢測技術(shù)是農(nóng)藥殘留及其代謝衍生物和其它小分子的重要分析方法。本論文開展了精喹禾靈免疫學(xué)檢測技術(shù)和儀器分析的研究，主要內(nèi)容包括精喹禾靈半抗原的設(shè)計(jì)，人工抗原的合成，多克隆抗體制備和相應(yīng)的ELISA檢測方法的建立，同時(shí)還對水和土壤中精喹禾靈的農(nóng)藥殘留進(jìn)行了檢測。 1.為了得到新型特異性抗體，以精喹禾靈水解產(chǎn)物精喹禾靈酸為半抗原，通過質(zhì)譜、核磁共振和紅外分析，成功合成了半抗原精喹禾靈酸。半抗原與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，分別合成了免疫原

2、(混合酸酐法(MAR))和包被原(活潑酯法(EDC或稱碳二亞胺法))，紫外全掃描證實(shí)成功地合成了免疫和包被所需的人工抗原。并計(jì)算人工抗原的偶聯(lián)比分別為Hapten-BSA是29,23，Hapten-OVA是7.87。 2.用Hapten-BSA作為免疫原免疫3只新西蘭大白兔(M4736、M4740和M4743)，獲得了抗精喹禾靈的特異性抗體，所得到的效價(jià)分別為1/80000、1/1280000、1/800000。因?yàn)镸4743的

3、效價(jià)最高，因此選用效價(jià)為1/800,000的血清M4743進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；經(jīng)方陣點(diǎn)滴和間接非競爭ELISA確定了血清M4743的工作濃度，M4743兔子抗血清的ELISA的最適工作濃度：包被原稀釋度為1/5,000(Hapten-OVA,2.05μg/mL)，血清稀釋度為1/200,000，此工作濃度用于ELISA方法。通過研究包被介質(zhì)、有機(jī)溶劑種類與含量、緩沖液離子強(qiáng)度等對抗原抗體反應(yīng)的親和力和分析靈敏度的影響，優(yōu)化了ELISA分析條件。在

4、優(yōu)化的工作條件下，用M4743血清建立的IC-ELISA，所得的抑制率曲線方程為I=31.793LogC+96.314，r=0.994，對精喹禾靈的抑制中濃度(IC50)為0.03495μg/mL，最低檢測濃度為0.00192μg/mL，檢測范圍為0.002-0.5μg/mL。在交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，與其結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)沒有交叉反應(yīng)。 3.對水和土壤的精喹禾靈殘留進(jìn)行分析，采用氣相色譜法(GC-NPD)測定，精喹禾靈的保留時(shí)間在14.2

5、35min，方法的線性范圍為0.04-1mg/L，線性方程為Y=4.0223x+0.1443，線性相關(guān)系數(shù)r為0.9995，最低檢出限為0.003mg/kg，符合殘留分析要求。 在水樣和土壤中分別添加0-1μg/mL的精喹禾靈，經(jīng)IC-ELISA(M4743)和氣相色譜(GC)分析檢測，水樣中精喹禾靈的添加回收率為分別為89.02-108.88％和90.9-115.0％，土樣樣中精喹禾靈的添加回收率為分別為78.95-112.7

6、5％和84.0-104.5％。兩種方法的添加回收率均大于78.9％，而且分析結(jié)果的相關(guān)性好，水樣和土壤中添加回收率的ELISA和GC的相關(guān)性方程：水樣中R2=0.9977，Y=0.9197X+0.0218；土壤中R2=0.9936，Y=1.1395X-0.009。 以上結(jié)果表明，制備的精喹禾靈抗體適用于對水樣和土壤中精喹禾靈農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速檢測，其結(jié)果與用儀器分析(GC-NPD)所得的檢測結(jié)果具有較好的相關(guān)性，具有良好的實(shí)用性。