孔雀石綠多克隆抗體的制備及其快速檢測(cè)方法的研究.pdf

1、孔雀石綠是一種合成的有毒三苯基甲烷類化合物，因具有預(yù)防和治療水產(chǎn)動(dòng)物真菌性疾病的作用，且價(jià)格低廉操作方被便，廣泛使用在水產(chǎn)養(yǎng)殖，臨床試驗(yàn)研究表明孔雀石綠對(duì)動(dòng)物器官具有高毒性、高殘留、致畸、致癌、致突變的副作用，因此研究一種能夠快速檢測(cè)孔雀石綠的ELISA方法，對(duì)水產(chǎn)品的安全檢查具有一定的實(shí)際意義。
　　本研究在分析孔雀石綠分子結(jié)構(gòu)和免疫原性的基礎(chǔ)上，合成羧基化孔雀石綠半抗原，半抗原與載體蛋白偶聯(lián)合成孔雀石綠人工抗原，用人工抗原免疫

2、兔子獲得孔雀石綠多克隆抗體，將孔雀石綠多克隆抗體進(jìn)行純化后用于間接ELISA并對(duì)其條件進(jìn)行優(yōu)化，從而建立間接ELISA快速檢測(cè)孔雀石綠的方法，主要研究結(jié)果如下：
　　1.通過(guò)化學(xué)方法，由原料4-甲?；郊姿岷蚇,N-二甲基苯胺合成羧基化隱色孔雀石綠（CLMG），再將其氧化生成羧基化孔雀石綠（CMG），分別采用活性酯法和碳二亞胺法偶聯(lián)羧基化孔雀石綠（CMG）獲得人工免疫原（CMG-BSA）和人工包被原（CMG-OVA），利用紫外分光

3、光度法測(cè)得半抗原與載體蛋白偶聯(lián)比分別為13.8：1(CMG-BSA)和17.1：1(CMG-OVA)。
　　2.用免疫原(CMG-BSA)免疫動(dòng)物，第4次免疫后用間接ELISA法初步測(cè)定兔子抗血清效價(jià)為1：3500，抗血清IC50值為40.44ng/mL。
　　3.通過(guò)辛酸-硫酸銨法對(duì)免疫血清進(jìn)行純化處理，經(jīng)SDS-PAGE，表明純化后的多克隆抗體純度較高，通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定純化后的多克隆抗體濃度為11.02mg/mL。

4、通過(guò)方陣滴定法確定包被原和純化抗體的最佳稀釋倍數(shù)分別為1：1000，1：8000。
　　4.在此基礎(chǔ)上對(duì)包被溶液的選擇、包被條件、封閉溶液的選擇、封閉條件、競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間、MG標(biāo)準(zhǔn)溶液與多克隆抗體體積比及抗體稀釋液進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化后重新建立MG標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-42.44x+71.08，R2=0.985。經(jīng)計(jì)算MG的半數(shù)抑制率IC50為:3.2ng/mL，檢測(cè)限（IC90）可達(dá)0.35ng/mL。孔雀石綠與結(jié)構(gòu)類似物