無(wú)色孔雀石綠殘留快速檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用.pdf

1、孔雀石綠(Malachite Green,MG)化學(xué)名為四甲基代二氨基三苯甲烷,分子式為C23H25ClN2,又名堿性綠、孔雀綠或者中國(guó)綠,屬三苯甲烷類染料,孔雀石綠在水生動(dòng)物體內(nèi)會(huì)很快代謝成無(wú)色孔雀石綠。孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物無(wú)色孔雀石綠成為重大的食品安全隱患。目前,孔雀石綠被我國(guó)被列為禁用漁藥,世界其他各國(guó),1992年加拿大就已經(jīng)禁止孔雀石綠及無(wú)色孔雀石綠作為漁場(chǎng)殺菌劑;美國(guó)政府給出了嚴(yán)格的規(guī)定,禁止在食用水產(chǎn)品中檢出孔雀石綠及其代謝

2、產(chǎn)物無(wú)色孔雀石綠;2002年6月,歐盟政府頒布了相關(guān)法令,禁止在任何漁場(chǎng)中違禁使用孔雀石綠。2002年5月,中國(guó)政府將孔雀石綠列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》中,禁止孔雀石綠用于所有食品動(dòng)物的養(yǎng)殖及運(yùn)輸過(guò)程。尤其是無(wú)色孔雀石綠,其與孔雀石綠相比在水產(chǎn)品中的殘留量更多,殘留時(shí)間較更長(zhǎng),因此,建立水產(chǎn)品中無(wú)色孔雀石綠的快速檢測(cè)技術(shù)已刻不容緩具有更加重要的意義。目前無(wú)色孔雀石綠的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法(TLC)、分光光度法、高效液相

3、色譜法(HPLC)等。這些方法操作繁瑣、儀器價(jià)格昂貴,需要專業(yè)的技術(shù)人員,而且不適合現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模的檢測(cè)。以免疫學(xué)方法為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法,具有快速、靈敏、價(jià)格低廉、適合現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),是目前公認(rèn)最適合作為藥物殘留檢測(cè)的快速篩選方法之一。酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒作為一種快速、靈敏、不需要任何儀器的檢測(cè)技術(shù)可作為無(wú)色孔雀石綠的藥物殘留現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的一種重要的初篩手段。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)合成無(wú)色孔雀石綠的人工抗原,免疫Balb/c小鼠后,通過(guò)采集免疫小鼠的

4、脾臟細(xì)胞,利用雜交瘤實(shí)驗(yàn)技術(shù)制備了可用于檢測(cè)無(wú)色孔雀石綠的單克隆抗體,并利用得到的特異性強(qiáng)的單克隆抗體制備了無(wú)色孔雀石綠的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。
　　首先,利用混酸硝化還原法對(duì)無(wú)色孔雀石綠進(jìn)行改造,獲得氨基無(wú)色孔雀石綠(NH2-LMG);同時(shí),采用結(jié)構(gòu)類似物副品紅(PA),然后采用改進(jìn)的碳二亞胺(carbodiimide)法制備了2種不同無(wú)色孔雀石綠完全抗原記作LMG-BSA和PA-BSA,通過(guò)紫外分光光度計(jì)掃描、聚丙烯酰胺 SDS

5、-PAGE凝膠電泳、質(zhì)譜分析等方法對(duì)無(wú)色孔雀石綠完全抗原LMG-BSA和PA-BSA進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明:紫外掃描都發(fā)現(xiàn)了峰的漂移;PA-BSA偶聯(lián)物質(zhì)譜圖中可觀察到分子量為78180的高分子化合物。對(duì)比BSA的分子量和PA的分子量,可以判斷偶聯(lián)成功且偶聯(lián)比率約為37:1,LMG-BSA偶聯(lián)物質(zhì)譜圖中可觀察到分子量為68759的高分子化合物。對(duì)比 BSA的分子量和NH2-LMG的分子量,可以判斷偶聯(lián)成功且偶聯(lián)比率約為7:1,利用LMG-B

6、SA和PA-BSA免疫小鼠,得到的血清效價(jià)均為105以上,表明制備得到的LMG-BSA和PA-BSA偶聯(lián)物均可以用于孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物無(wú)色孔雀石綠人工抗原的制備。
　　將LMG-BSA和PA-BSA偶聯(lián)物分別免疫5只小白鼠,加強(qiáng)免疫后獲得多抗血清,分別采用LMG-OVA和PA-OVA作為包被原進(jìn)行血清效價(jià)測(cè)定,結(jié)果表明各抗體血清的效價(jià)均高于105。實(shí)驗(yàn)中選取血清效價(jià)最高的BALB/C小鼠用于細(xì)胞融合。采用雜交瘤技術(shù)將脾臟與SP2

7、/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。然后采用間接ELISA以及間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選,同時(shí)利用有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆,最終篩選出4株穩(wěn)定的可分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,LMG-BSA免疫獲得兩株分別是B8、D5,PA-BSA免疫獲得兩株分別是E9和H-6。最后通過(guò)腹水大量制備單克隆抗體,采用飽和過(guò)硫酸銨法純化獲得單克隆抗體。對(duì)單克隆抗體的特性鑒定結(jié)果表明:這四株單克隆抗體的親和力能達(dá)到108L/mol,均屬于高

8、親和力的單克隆抗體,通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,四株單克隆抗體B8、D5、E9和H6的最低檢測(cè)限分別為5.61μ g/L、3.98μ g/L、4.62μ g/L和12.04μ g/L,均屬于高靈敏的抗體;同時(shí)單克隆抗體的特異性良好,均可用于檢測(cè)水產(chǎn)品中無(wú)色孔雀石綠殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒的開(kāi)發(fā)。
　　本實(shí)驗(yàn)采用過(guò)碘酸鈉法,對(duì)實(shí)驗(yàn)合成的完全人工抗原PA-BSA進(jìn)行了辣根過(guò)氧化物酶的標(biāo)記,成功的制備得到了辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記PA-BSA,通過(guò)紫外分光

9、光度計(jì)和ELISA實(shí)驗(yàn)實(shí)際操作,對(duì)制備得到的HRP酶標(biāo)記抗原進(jìn)行了鑒定,實(shí)驗(yàn)鑒定的結(jié)果表明,HRP酶標(biāo)記抗原的效果良好,可用于ELISA試劑盒的建立。以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的完全抗原為基礎(chǔ),成功的建立了酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒,并對(duì)其檢測(cè)性能進(jìn)行測(cè)定,在實(shí)驗(yàn)室建立前處理?xiàng)l件下,該酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒最低檢測(cè)限為370 ng/L,能夠用于水產(chǎn)品中無(wú)色孔雀石綠的殘留檢測(cè)。
　　綜上,本實(shí)驗(yàn)制備的無(wú)色孔雀石綠酶聯(lián)免疫試劑盒可用于水產(chǎn)品中無(wú)色孔雀石